內(nèi)源性炎性物質(zhì)與神經(jīng)肽P物質(zhì)對感覺神經(jīng)元中T型鈣通道的調(diào)節(jié)及其在神經(jīng)元興奮性和疼痛中的作用.pdf

1、T型鈣通道（又名低電壓激活鈣通道，LVA）家族由三種亞型所組成：CACNA1G編碼的Cav3.1，CACNA1H編碼的Cav3.2，CACNA1I編碼的Cav3.3。這些通道因其低電壓激活特性使得其可在神經(jīng)元靜息膜電位附近被部分激活，并具有快激活、快失活、慢去活特性。越來越多的研究報道T型鈣通道在外周痛覺通路中有重要的作用。在外周軀體感覺系統(tǒng)，T型鈣通道主要表達于小的、TRPV1敏感的傷害性感覺神經(jīng)元和低閾值機械感受器（LTMRs），包

2、括Aδ-LTMRs和C-LTMRs。這些感受器分布于皮膚毛囊。已有研究報道，外周感覺神經(jīng)元中表達的 T型鈣通道亞型主要是Cav3.2亞型。Cav3.2在多種外周神經(jīng)纖維中都有表達，如，皮膚傳入纖維的軸突、外周傷害性感受器的神經(jīng)末梢、Aδ纖維的郎飛結(jié)、脊髓背角中傷害性感受纖維的突觸前末端。有研究表明，鞘內(nèi)注射反義核苷酸敲低背根神經(jīng)節(jié)（DRG）中的Cav3.2亞型可以顯著降低神經(jīng)痛和炎性痛模型的疼痛反應；T型鈣通道的阻斷劑在鋸齒類動物疼痛模

3、型中發(fā)揮顯著的鎮(zhèn)痛作用。T型鈣通道幾種亞型已被作為臨床鎮(zhèn)痛藥物作用靶點研究了很長時間，且目前有幾種新型的 T型鈣通道特異性阻斷劑作為鎮(zhèn)痛藥物已進入臨床試驗階段。
　　相反，如果痛覺通路中的 T型鈣通道通道活性增加或者表達量增加可以引起痛覺增敏現(xiàn)象。在許多病理性疼痛（如，糖尿病神經(jīng)病變，外周神經(jīng)損傷或炎癥反應）中，均表現(xiàn)出 T型鈣電流表達增加。雖然緩激肽（Bradykinin，BK）、三磷酸腺苷（Adenosine triphosp

4、hate，ATP）、去甲腎上腺素（Norepinephrine bitartrate，NE）和前列腺素E2（Prostaglandin E2， PGE2）是已知的可以引起疼痛的炎性物質(zhì)，但至今沒有系統(tǒng)研究這些內(nèi)源性物質(zhì)對于 T型鈣通道的調(diào)節(jié)作用，及其調(diào)節(jié)作用下的作用機制的報道。本研究第一部分將集中研究這四種內(nèi)源性炎性物質(zhì)對于急性分離培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中的T型鈣通道的調(diào)節(jié)作用，及其產(chǎn)生相應調(diào)節(jié)作用的機制。
　　T型鈣通道（又名低電壓

5、激活鈣通道，LVA）家族由三種亞型所組成：CACNA1G編碼的Cav3.1，CACNA1H編碼的Cav3.2，CACNA1I編碼的Cav3.3。這些通道因其低電壓激活特性使得其可在神經(jīng)元靜息膜電位附近被部分激活，并具有快激活、快失活、慢去活特性。越來越多的研究報道T型鈣通道在外周痛覺通路中有重要的作用。在外周軀體感覺系統(tǒng)，T型鈣通道主要表達于小的、TRPV1敏感的傷害性感覺神經(jīng)元和低閾值機械感受器（LTMRs），包括Aδ-LTMRs和C

6、-LTMRs。這些感受器分布于皮膚毛囊。已有研究報道，外周感覺神經(jīng)元中表達的 T型鈣通道亞型主要是Cav3.2亞型。Cav3.2在多種外周神經(jīng)纖維中都有表達，如，皮膚傳入纖維的軸突、外周傷害性感受器的神經(jīng)末梢、Aδ纖維的郎飛結(jié)、脊髓背角中傷害性感受纖維的突觸前末端。有研究表明，鞘內(nèi)注射反義核苷酸敲低背根神經(jīng)節(jié)（DRG）中的Cav3.2亞型可以顯著降低神經(jīng)痛和炎性痛模型的疼痛反應；T型鈣通道的阻斷劑在鋸齒類動物疼痛模型中發(fā)揮顯著的鎮(zhèn)痛作用

7、。T型鈣通道幾種亞型已被作為臨床鎮(zhèn)痛藥物作用靶點研究了很長時間，且目前有幾種新型的 T型鈣通道特異性阻斷劑作為鎮(zhèn)痛藥物已進入臨床試驗階段。
　　相反，如果痛覺通路中的 T型鈣通道通道活性增加或者表達量增加可以引起痛覺增敏現(xiàn)象。在許多病理性疼痛（如，糖尿病神經(jīng)病變，外周神經(jīng)損傷或炎癥反應）中，均表現(xiàn)出 T型鈣電流表達增加。雖然緩激肽（Bradykinin，BK）、三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）、去

8、甲腎上腺素（Norepinephrine bitartrate，NE）和前列腺素E2（Prostaglandin E2， PGE2）是已知的可以引起疼痛的炎性物質(zhì)，但至今沒有系統(tǒng)研究這些內(nèi)源性物質(zhì)對于 T型鈣通道的調(diào)節(jié)作用，及其調(diào)節(jié)作用下的作用機制的報道。本研究第一部分將集中研究這四種內(nèi)源性炎性物質(zhì)對于急性分離培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中的T型鈣通道的調(diào)節(jié)作用，及其產(chǎn)生相應調(diào)節(jié)作用的機制。
　　P物質(zhì)（SP）是一種十一個氨基酸多肽，屬于速

9、激肽家族，在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)均有表達。SP是一種主要的興奮性遞質(zhì)，其可參與痛覺傳遞、肌肉收縮、炎性調(diào)節(jié)和免疫應答等過程。SP可被哺乳動物外周軀體感覺系統(tǒng)的傷害性感覺神經(jīng)元中的TRPV1陽性細胞所大量產(chǎn)生。當中樞或外周受到傷害性刺激時均會釋放SP。外周傷害性神經(jīng)纖維末端釋放SP引起所謂的“神經(jīng)性炎癥”，在脊髓背角SP促進興奮性遞質(zhì)谷氨酸釋放。SP通過激活NK1（一種G蛋白偶聯(lián)受體）受體發(fā)揮胞內(nèi)作用。目前尚未見有關(guān)SP調(diào)節(jié)T型鈣通道功能的

10、報道。
　　越來越多的證據(jù)表明，T型鈣通道可被氧化還原機制所調(diào)節(jié)，L-型半胱氨酸等還原性物質(zhì)可以顯著性增大外周神經(jīng)系統(tǒng)DRG神經(jīng)元中的T型鈣電流，抗壞血酸和N2O等可促進細胞釋放ROS的物質(zhì)可以抑制DRG神經(jīng)元中的 T型鈣電流等。另外具有自由電子的活性氮也可以通過氧化還原作用調(diào)節(jié) T型鈣通道功能。但至今為止，人們對這些氧化還原調(diào)節(jié)下的分子調(diào)節(jié)機制了解并不深刻。這也成為了 T型鈣通道更深入研究的瓶頸。本研究第二部分主要是利用大鼠背根

11、神經(jīng)元以及人胚腎上皮（HEK）細胞研究SP對T型鈣電流，尤其是Cav3.2亞型的調(diào)節(jié)作用及其作用機制。
　　因為P物質(zhì)在脊髓痛覺通路中強大的興奮性作用，針對NK1受體拮抗劑的新型鎮(zhèn)痛藥物的研究方興未艾。然而，盡管有許多強有力的臨床前數(shù)據(jù)被報道，但NK1受體拮抗劑的臨床實驗均以失敗告終。導致這一困惑的原因可能與SP在中樞和外周有不同作用有關(guān)，即不同于其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的興奮作用，SP在外周傷害性通路中可能存在抑制性或鎮(zhèn)痛作用。本研究

12、第三部分部分我們將圍繞這個問題展開研究，通過傳統(tǒng)的電生理手段研究S9SP（一種NK1受體激動劑）、Z944（T型鈣通道特異性阻斷劑）、ST101（T型鈣通道特異性開放劑）對外周神經(jīng)元DRG興奮性的調(diào)節(jié)，并研究這些藥物在整體動物疼痛中的調(diào)節(jié)作用。論文具體內(nèi)容如下：
　　第一部分內(nèi)源性炎性物質(zhì)緩激肽、三磷酸腺苷、去甲腎上腺素、前列腺素2對DRG神經(jīng)元中T型鈣通道的作用
　　目的：研究幾種內(nèi)源性炎性物質(zhì)對DRG中T型鈣通道的調(diào)節(jié)及

13、其作用機制。
　　方法：1急性分離培養(yǎng)大鼠 DRG神經(jīng)元，藥物孵育過夜。2利用膜片鉗技術(shù)、細胞免疫熒光技術(shù)和PCR技術(shù)研究幾種炎性物質(zhì)對T型鈣通道的調(diào)節(jié)及其作用機制。
　　結(jié)果：1用緩激肽（BK，100 nM），三磷酸腺苷（ATP，2μM），去甲腎上腺素（NE，500 nM），前列腺素E2（PGE2，500 nM）的混合藥物(Inf.)過夜孵育培養(yǎng)第二天的成年雄性大鼠DRG神經(jīng)元。膜片鉗結(jié)果顯示炎性藥物混合劑孵育過夜后，與溶

14、劑（DMEM）對照組比處理組DRG神經(jīng)元中表達 T型鈣通道的細胞數(shù)量顯著性增加，從對照組的21/43（48.8％），上升到Inf.孵育組的31/42（73.8%）（P<0.05）。但對平均電流峰值沒有顯著影響，平均電流大小分別為-113.6±18.5 pA（DMEM組）和-105.3±14.5 pA（Inf.組）。Inf.孵育24 h并沒有引起DRG神經(jīng)元凋亡。2 BK與ATP各自單獨過夜孵育也可引起T型鈣電流陽性細胞比例明顯增加，從對

15、照組的25/54（46.3%）增加到43/54（79.6%，BK組）（P<0.05)和39/56（69.9%，ATP組）（P<0.05）。而NE和PGE2無此作用。且這些藥物孵育對T型鈣電流大小均無影響。3 PLC阻斷劑U-73122或B2受體阻斷劑Hoe-140孵育可阻斷Inf.孵育引起的T型鈣電流陽性細胞比例增大，而P2X2/P2X3阻斷劑A-317491并無此作用。4蛋白酶體抑制劑MG132（5μM）可降低通道蛋白泛素化，孵育細胞

16、并不能引起T型鈣電流陽性細胞比例的增加。PCR結(jié)果顯示，炎性物質(zhì)單獨或共孵育后， DRG神經(jīng)元中Cav3.2亞型mRNA表達量并無明顯變化。細胞免疫熒光結(jié)果顯示，炎性物質(zhì)單獨或共孵育對DRG細胞中總的Cav3.2通道蛋白的表達并無影響。
　　結(jié)論：1 BK和ATP孵育可引起DRG神經(jīng)元中T型鈣電流陽性細胞比例增加。2 BK和ATP的作用是通過激活Gq/11-PLC通路所致。
　　第二部分 P物質(zhì)對T型鈣通道的調(diào)節(jié)作用及機制的

17、研究
　　目的：研究SP（S9SP）對DRG神經(jīng)元中T型鈣通道的作用，應用電生理和分子生物學手段研究S9SP產(chǎn)生作用的分子機制。
　　方法：1使用電生理膜片鉗技術(shù)觀察S9SP對DRG神經(jīng)元和HEK細胞中過表達的T型鈣通道作用。2利用siRNA干擾技術(shù)及藥理學阻斷劑研究S9SP對T型鈣通道調(diào)節(jié)作用偶聯(lián)的G蛋白通路。3應用多種內(nèi)源性或外源性藥物采用電生理技術(shù)、細胞鋅成像技術(shù)、原子分光光度法等技術(shù)研究S9SP引起T型鈣通道功能改變

18、的分子機制。4利用藥理氧化劑及定點突變技術(shù)研究S9SP下游信號分子在通道蛋白上的具體作用位點。
　　結(jié)果：1 S9SP可以濃度依賴性地抑制中、小直徑，痛覺相關(guān)的DRG神經(jīng)元中的T型鈣電流，IC50為6.20±2.99 nM。21μM S9SP可以產(chǎn)生最大抑制，抑制率為22.5±2.3%。一種 NK1受體特異性激動劑Sar9-Met(O2)11-SP（1μM）可以對DRG神經(jīng)元中的T型鈣電流產(chǎn)生相似程度的抑制，抑制率為26.6±4.

19、7%。NK1受體特異性拮抗劑 CP-99994幾乎完全阻斷S9SP所引起的T型鈣電流的抑制。但S9SP對DRG神經(jīng)元中的高電壓激活鈣電流（HVA）并無影響。3 PTX預孵育過夜可完全阻斷S9SP引起的對DRG神經(jīng)元T型鈣電流的作用。使用siRNA將Gq和G11 mRNA水平敲低至基礎水平（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA）的20%左右，發(fā)現(xiàn)并未對S9SP的作用造成影響，其仍可對T型鈣電流產(chǎn)生27.1±3.8%的抑制；而當用siRNA敲低Gi和Go

20、表達水平至基礎水平（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA）的20%左右時，S9SP對DRG神經(jīng)元中T型鈣電流的抑制作用則幾乎完全消除，抑制率僅為2.5±2.6%。同時發(fā)現(xiàn)，PKC抑制劑BIM I并不能影響S9SP對T型鈣電流的抑制作用。4還原性物質(zhì)DTT（二硫蘇糖醇）幾乎完全逆轉(zhuǎn)S9SP引起的T型鈣電流的抑制作用；另外氧化性物質(zhì)H2O2和Antimycin A可以模擬S9SP對T型鈣電流的作用。5 ZnCl2可著抑制T型鈣電流，抑制率為24.55±4

21、.3%；鋅存在時S9SP不能引起T型鈣電流進一步的抑制。鋅螯合劑TPEN可消除S9SP對T型鈣電流的抑制作用，并可逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)生的抑制作用。6共聚焦鋅成像和原子吸收分光光度法實驗表明，S9SP孵育細胞并不能改變細胞內(nèi)/外鋅濃度。7 S9SP存在時可增大低濃度鋅對Cav3.2電流的抑制作用。8氨基酸點突變實驗表明，Cav3通道上鋅的高親和位點在S9SP引起的Cav3電流抑制作用中至關(guān)重要。9利用兩種氧化劑NEM（透膜的氧化劑）和MTSES（

22、不透膜的氧化劑）的實驗發(fā)現(xiàn)，MTSES能抑制表達于 HEK293細胞的 Cav3.2電流，且作用特點與S9SP相似；而NEM呈現(xiàn)非特異性抑制作用。10將Cav3.2中S1-S2胞外連接的三個連接環(huán)上的半胱氨酸和S1跨膜區(qū)的一個半胱氨酸突變?yōu)楸彼岷蟀l(fā)現(xiàn)，這四個位點的突變顯著性降低了MTSES對突變通道電流的抑制作用。
　　結(jié)論：1 S9SP激活DRG神經(jīng)元中NK1受體進而激活Gi/o信號通路，抑制T型鈣通道；2 S9SP誘導內(nèi)源性

23、釋放ROS從而通過ROS通路抑制T型鈣電流。3 ROS調(diào)節(jié)通道對鋅的親和力，進而抑制T型鈣電流；4同源區(qū)域I中的S1-S2連接片段中的一個或幾個半胱氨酸介導了Cav3.2的氧化還原作用。
　　第三部分 SP對 T型鈣通道的調(diào)節(jié)在神經(jīng)元興奮性及外周疼痛中作用的研究
　　目的：研究SP介導的T型鈣通道的調(diào)節(jié)在大鼠DRG神經(jīng)元興奮性及動物疼痛行為中的作用。
　　方法：1使用電流鉗技術(shù)，研究 T型鈣通道特異性阻斷劑 Z944、

24、T型鈣通道特異性開放劑ST101和NK1受體激動劑S9SP對DRG神經(jīng)元興奮性的影響。2動物疼痛模型由大鼠腳掌注射緩激肽（BK）、機械刺激或熱源刺激所造成。在這些疼痛模型上觀察腳掌注射Z944、S9SP和ST101對疼痛行為的影響。3鞘內(nèi)注射反義核苷酸敲低大鼠DRG（L4-L6）中的Cav3.2表達水平，進一步研究T型鈣通道在S9SP對疼痛行為影響中的作用。
　　結(jié)果：1 Z944可以顯著增加動作電位的rheobase，減少動作電

25、位（AP）個數(shù)，并且使靜息膜電位（Erest）超極化，但對 AP峰值和 AP持續(xù)時間沒有顯著影響。相反，ST101可以顯著增加動作電位爆發(fā)次數(shù)并使 Erest去極化，同樣對AP峰值和AP時程沒有顯著影響。S9SP對DRG神經(jīng)元興奮性的影響與Z944作用趨勢相同，雖然只有對rheobase的作用達到了統(tǒng)計學差異。siRNA敲低培養(yǎng)DRG神經(jīng)元中Cav3.2表達可以消除Z944和ST101對神經(jīng)元興奮性的影響。2 BK單獨灌流可以顯著降低r

26、heobase，增加動作電位爆發(fā)個數(shù)，使Erest去極化。S9SP和Z944則可抑制BK的作用，都幾乎使BK引起的rheobase降低和動作電位個數(shù)增加恢復至原來水平。3大鼠腳掌分別注射0.02μM，0.2μM，2μM和200μM ST101可以引起明顯的疼痛反應。4大鼠腳掌注射Z944（1μM，10μM，100μM）三個不同濃度均可顯著性增加大鼠熱痛閾值。5大鼠腳掌注射S9SP可以顯著降低大鼠腳掌對輕觸覺的反應，Z944腳掌注射產(chǎn)生相

27、似的作用；大鼠腳掌注射ST101可以增加大鼠腳掌對輕觸覺的敏感程度。6提前注射RTG（M-型鉀通道開放劑）或Z944可以顯著降低之后注射BK所引起的疼痛，預注射S9SP同樣顯著降低BK注射引起的疼痛反應。RTG和Z944共同預注射可以引起與S9SP注射相似的鎮(zhèn)痛反應。7利用反義核苷酸鞘內(nèi)注射敲低大鼠DRG中Cav3.2水平可以消除Z944引起的鎮(zhèn)痛作用，降低S9SP引起的鎮(zhèn)痛作用，提示T型鈣通道的參與。
　　結(jié)論：1 T型鈣通道開