利用PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)從野生褐家鼠和屋頂鼠中檢測(cè)路氏錐蟲(chóng)(Trypanosoma lewisi).pdf

1、路氏錐蟲(chóng)(Trypanosoma lewisi)是一種血液鞭毛蟲(chóng)，主要的中間宿主是褐家鼠(Rattus norvegicus)和屋頂鼠(Rattusrattus)，通過(guò)跳蚤傳播，呈全球性分布。長(zhǎng)期以來(lái)，人們普遍認(rèn)為路氏錐蟲(chóng)是一種宿主特異性極強(qiáng)的非致病性原蟲(chóng)。但是，這一觀念目前正在受到挑戰(zhàn)，因?yàn)槿烁腥韭肥襄F蟲(chóng)的病例被陸續(xù)報(bào)道，且病人有明顯的臨床癥狀。路氏錐蟲(chóng)作為一種新的人獸共患病原體已引起世界衛(wèi)生組織(World Health Organ

2、ization)的重視。
　　 目前檢測(cè)路氏錐蟲(chóng)的方法主要是病原學(xué)檢查，取血液涂片觀察到蟲(chóng)體即可確診。病原學(xué)檢測(cè)準(zhǔn)確率高，為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但該法不便于大規(guī)模篩查，且靈敏度較低。因此，發(fā)展一種新的檢測(cè)路氏錐蟲(chóng)的方法顯得尤為重要。環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)有簡(jiǎn)單、快速高效、高特異性、高靈敏性和成本低等優(yōu)點(diǎn)，適合流行病學(xué)的大規(guī)模篩查。
　　

3、本論文率先建立了檢測(cè)路氏錐蟲(chóng)的LAMP體系，明確了檢測(cè)路氏錐蟲(chóng)的最佳反應(yīng)溫度為62℃，最佳反應(yīng)時(shí)間是60min。對(duì)LAMP檢測(cè)路氏錐蟲(chóng)的特異性和靈敏性進(jìn)行了詳細(xì)的研究，結(jié)果表明采用的引物對(duì)路氏錐蟲(chóng)有甚高的特異性，LAMP能檢測(cè)到的DNA極限水平為10fg，普通PCR能檢測(cè)到的DNA極限水平為100fg，LAMP檢測(cè)路氏錐蟲(chóng)的靈敏度比普通PCR高10倍。此外，本研究結(jié)果證實(shí)，用FTA濾紙保存的血樣無(wú)需作DNA純化處理便可直接用于LAMP反

4、應(yīng)，結(jié)果與預(yù)處理的沒(méi)有明顯差異，但是未經(jīng)處理的FTA濾紙保存的血樣不能直接用于普通PCR反應(yīng)。這表明LAMP反應(yīng)對(duì)大分子有機(jī)物的耐受性要比普通PCR強(qiáng)。
　　 本論文用三種方法檢測(cè)了238只野生大鼠血樣，結(jié)果表明：病原學(xué)檢測(cè)(顯微鏡)陽(yáng)性率為6.7％(16/238)，PCR檢測(cè)陽(yáng)性率為12.6％(30/238)，LAMP檢測(cè)陽(yáng)性率為18.9％(45/238)，且病原學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性樣本在PCR和LAMP中均檢測(cè)出陽(yáng)性，PCR檢測(cè)的陽(yáng)性

5、樣本在LAMP中均檢測(cè)出陽(yáng)性。PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率高于病原學(xué)檢測(cè)，而LAMP檢測(cè)的陽(yáng)性率高于PCR檢測(cè)。對(duì)比這三種方法，本文發(fā)現(xiàn)，LAMP檢測(cè)路氏錐蟲(chóng)有更高的靈敏性，更適合用于路氏錐蟲(chóng)大樣品量的流行病學(xué)研究。
　　 本文利用FTA濾紙采集血液樣本，結(jié)合LAMP技術(shù)檢測(cè)路氏錐蟲(chóng)，建立了從樣本采集、運(yùn)輸、貯存和檢測(cè)于一體的一套完整LAMP檢測(cè)體系?；诶肔AMP檢測(cè)路氏錐蟲(chóng)的研究，本文的結(jié)果表明LAMP是一種快速、簡(jiǎn)便、成本低、高靈