環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術檢測牛肉中大腸桿菌O157的研究.pdf

1、分類號：!墨2Q2：壘密級：公玨單位代碼：學號：!鯉墨魚2鯉墨12l環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術檢測牛肉中大腸桿菌0157的研究StudyonaloopmediatedisothermalAmplification(LAMP)forthedetectionof‘?！痗herichiacoli0inbe；fleScherichiacoil0I57Inbeel學位申請人：梁磊指導教師：張偉教授學科專業(yè)：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程學位類別：農(nóng)學

2、碩士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學答辯日期：二。一一年五月二十九日摘要1885年，德國科學家TEsch撕ch首次發(fā)現(xiàn)大腸桿菌0157：H7，它是引起腹瀉的重要致病菌。大多數(shù)食物中毒都可追溯到牛肉和未消毒的牛奶，而且感劑量小于100個細菌即可引起感染。目前對大腸桿菌0157：H7的檢測方法主要有傳統(tǒng)的常規(guī)培養(yǎng)法、免疫學檢測方法和以PCR為代表的分子生物學檢測方法。傳統(tǒng)方法操作繁瑣，檢測時間長，而且靈敏度較低；免疫學檢測方法特異性和靈敏度不理想；P

3、CR方法敏感、快速，但由于需要昂貴的儀器設備、繁瑣的電泳過程，難以在基層普及和推廣。采用環(huán)介導等溫擴增(Loopmediatedisothermalamplification，LAMP)技術，檢測食品中的大腸桿菌0157：H7，具有靈敏度高，特異性強，檢測方法簡便，耗時短，檢測成本低等特點，適宜在基層普及和推廣。本研究針對大腸桿菌0157：H7(IQCC10102)帕E保守序歹lJ(Genbank$83460)，運用在線引物設計軟件(h

4、ttp：／／primerexplorerjp／e／indexhtml)設計LAMP引物。對BST酶添加量、dNTP濃度、鎂離子濃度等擴增條件進行了優(yōu)化，確定25“L的LAMP反應體系為：內引物(FIP和BIP)各16IxM，外引物(F3和B3)各02laM，環(huán)引物(LB)O8laM，06mMdNTP，30mMMgCl2，10BstDNA聚合酶反應緩沖液，8UBstDNA聚合酶大片段，1肛LDNA模板和滅菌雙蒸水。LAMP反應過程是：64

5、℃水浴鍋中反應20min，然后將其放入80℃水浴鍋中，水浴10min終止反應，通過肉眼觀察有無白色焦磷酸鎂沉淀，判斷是否發(fā)生LAMP反應。為了比較LAMP檢測大腸桿菌0157：H7靈敏度和人工污染的檢出限，以PCR方法作對照。PCR引物是LAMP的兩條外引物(F3和B3)。結果表明：LAMP檢測大腸桿菌0157：H7的靈敏度為98CFU／mL，人工污染牛肉的檢出限為68CFU／g。PCR檢測大腸桿菌0157：H7的靈敏度為980CFU／

6、mL，人工污染牛肉的檢出限為68x103CFU／g。采用試劑盒法提取DNA，從樣品處理到報告結果，LAMP方法約耗時2h，PCR方法約耗時3h。利用LAMP方法對19株腸道致病菌進行特異性試驗。結果表明：三株大腸桿菌0157為陽性，其他16株菌均為陰性。初步研究了3種模板制備方法對LAMP檢測牛肉中大腸桿菌0157：H7的影響。結果表明，LAMP方法對制備模板DNA的要求不高。研究表明：LAMP技術是一種檢測程序簡單、靈敏度和特異性較高