華支睪吸蟲ATP合酶b亞基的定位與細胞周期的關(guān)系.pdf

1、華支睪吸蟲病(clonorchiasis)又稱肝吸蟲病，是由華支睪吸蟲(Clonorchissinensis)感染引起的人獸共患寄生蟲病。華支睪吸蟲成蟲寄生于人或其它終宿主的肝膽管內(nèi)，可對肝膽系統(tǒng)造成慢性損傷，引起膽管局限性擴張、膽管上皮增生、膽管炎、肝硬化甚至誘發(fā)肝膽管腫瘤。全世界將近3500萬人感染華支睪吸蟲。我國目前感染人數(shù)為1249萬，分布在除西北數(shù)個省區(qū)外的25個省，以廣東省感染率為最高。 華支睪吸蟲作為復(fù)殖目吸蟲的典

2、型代表，是一種比較好的模式生物。隨著模式生物基因組研究的展開，研究者開始通過對華支睪吸蟲結(jié)構(gòu)基因組和功能基因組的研究來探討華支睪吸蟲在復(fù)雜的生活史過程中其基因的表達調(diào)控、能量代謝以及與宿主之間相互作用的分子機制。華支睪吸蟲寄生在膽管中，以厭氧代謝為主。其能量代謝的特點，尤其是線粒體在厭氧條件下ATP合酶的結(jié)構(gòu)和功能特征，值得深入研究。本研究主要通過對該基因的研究來了解華支睪吸蟲ATP合酶的某些結(jié)構(gòu)和功能特征。 生物信息學(xué)的預(yù)測結(jié)

3、果顯示華支睪吸蟲ATP合酶b亞基具有線粒體靶向序列和細胞核定位序列，這種截然不同的細胞內(nèi)區(qū)室分布是否真實?調(diào)控該蛋白進入線粒體和細胞核的因素是什么?對細胞的能量代謝有什么意義?為了澄清這些疑問，闡明ATP合酶b亞基的亞細胞定位至關(guān)重要。蛋白的亞細胞定位，除了通常采用的免疫組化電鏡外，利用綠色熒光蛋白作為示蹤物，與目的基因在真核細胞中融合表達，也可模擬蟲體內(nèi)蛋白的亞細胞定位。本研究通過設(shè)計3種去除靶向序列的突變體基因與綠色熒光蛋白真核載體

4、pEGFP-N1在HeLa細胞融合表達，并對不同細胞周期融合蛋白的定位和表達水平進行觀察和測定，探討華支睪吸蟲ATP合酶b亞基的亞細胞定位和參與細胞能量代謝調(diào)控的方式。 本研究對于深入了解寄生蟲細胞生物學(xué)和篩選可能的抗寄生蟲藥物的新靶點有重要意義。 研究結(jié)果 1．CsATP-synt B基因的篩選和鑒定Blastx分析該基因為全長基因，屬于ATP合酶b亞基家族，其分子進化樹與種系進化過程非常吻合。該基因全長100

5、8bp，其ORF含900bp，編碼300個氨基酸，其推導(dǎo)的氨基酸序列與人ATP-synt_B一致性達到41﹪，相似性達59﹪。Predictprotein預(yù)測該蛋白是一個膜蛋白，有兩個跨膜區(qū)(117-134、142-159)；α螺旋(H)、β折疊(E)和無規(guī)卷曲(L)的比例分別是68.67﹪：5.67﹪：25.67﹪，二級結(jié)構(gòu)以α螺旋(H)為主。只有少數(shù)氨基酸殘基包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部，大部分氨基酸殘基暴露在溶液界面。Mitoprot分析其含

6、有線粒體轉(zhuǎn)運序列(1-29)，Motifscan分析其有核定位序列(染色體二深裂結(jié)合區(qū)，239-256)和多個磷酸化位點，具有較穩(wěn)定的理化性質(zhì)。其編碼氨基酸理論分子量為34319.4，理論等電點9.04；去除線粒體轉(zhuǎn)運序列之后，編碼271個氨基酸，理論分子量為31131.7，理論等電點7.90。 2．CsATP-synt_B<'30-300>基因的原核克隆表達和重組蛋白的免疫組織定位設(shè)計引物從質(zhì)粒cDNA文庫中擴增CsATP-s

7、ynt_B<'30-300>，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA條帶在750bp與1000bp之間，測序確定為813bp，與篩選得到的CsATP-synt_B基因cDNA序列一致。定向克隆獲得的重組原核表達質(zhì)粒pET-28a(+)-CsATP-synt_B<'30-300>經(jīng)PCR、雙酶切和測序鑒定后證實構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒在1mmol/L IPTG、28℃下誘導(dǎo)表達重組融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE顯示與理論預(yù)測的融合蛋白分子量35781.0相符

8、。將純化的CsATP-synt_B<'30-300>免疫SD大鼠，獲得了大鼠抗CsATP-synt_B<'30-300>抗血清。重組蛋白免疫大鼠能產(chǎn)生高水平的抗體(ELISA效價達25,600)，表明其具有良好的免疫原性；通過Western-blotting方法，重組蛋白可被免疫血清所識別，表明含有線性表位，與生物信息學(xué)手段所做的表位分析和結(jié)構(gòu)分析相符。 經(jīng)過免疫組織定位，發(fā)現(xiàn)CsATP-synt_B<'30-300>蛋白在華支

9、睪吸蟲成蟲蟲體的分布比較廣泛，幾乎遍布整個蟲體，其中腹吸盤、卵巢、卵黃腺和體表的熒光比較強，說明在這四個部位能量代謝比較旺盛。 3．CsATP-synt_B在Hela細胞中模擬蟲體亞細胞定位與細胞周期的關(guān)系設(shè)計引物從華支睪吸蟲cDNA文庫擴增相應(yīng)的片段，克隆4個真核重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR、雙酶切和測序證實構(gòu)建成功。 將構(gòu)建好的真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，提取質(zhì)粒，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Hela細胞，倒置熒光顯微鏡下觀察各重組質(zhì)粒的

10、表達，對照組pEGFP-N1在Hela細胞整個細胞都有表達，是均質(zhì)分布；對照組pEYFP-Mito是定向于線粒體的質(zhì)粒，它在細胞核中未見有黃色熒光；H<,2>B-CFP是定向于細胞核的質(zhì)粒，在細胞核中顯示青色熒光，在細胞質(zhì)中未見表達。pEGFP-N1-CsATP-synt_B<'1-300>細在Hela細胞的線粒體和細胞核均有表達，同時在線粒體中表達的情況與pEYFP-Mito相符。與3個突變體的比較如下：pEGFP-N1-CsATP-

11、synt_B<'30-300>在胞漿中的表達與空載體pEGFP-N1相符都是均質(zhì)分布于整個Hela細胞，而有些細胞在細胞核中有表達，有些沒有，這可能與細胞周期不同時點有關(guān)；pEGFP-N1-CsATP-synt_B<'(1-238)+(257-300)在Hela細胞中的表達情況與載體pEYFP-Mito相似，在細胞核中少見有表達；而pEGFP-N1-CsATP-synt_B<'(30-238)+(257-300)的表達情況與與空載體pE

12、GFP-N1極其相似，整個細胞在鏡下發(fā)出綠色熒光。 對轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-CsATP-synt_B<'1-300>的Hela細胞進行同步化處理，分析在不同的細胞周期該融合蛋白的表達和細胞定位的變化。經(jīng)過流式細胞術(shù)檢測，空載體pEGFP-N1在G<,0>/G<,1>期表達量明顯下降，而pEGFP-N1-CsATP-synt_B<'1-300>在這個時期表達量是呈上升的趨勢。其他細胞周期時相，熒光表達量的變化趨勢相似。倒置熒光顯微

13、鏡觀察發(fā)現(xiàn)融合蛋白在G<,1>期進入細胞核，其它時期主要分布在線粒體。 在不同的細胞周期，通過對CsATP-synt_B<'1-300>和Hela細胞HomoATP-synt_BmRNA的表達進行半定量RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)融合蛋白在G<,1>期進入細胞核后，兩種基因的表達均成上升趨勢，說明融合蛋白進入細胞核是受細胞周期的調(diào)控，并且對目的基因CsATP-synt_B<'1-300>的表達起活化作用。 研究結(jié)論 1

14、．通過華支睪吸蟲cDNA文庫的篩選結(jié)合生物信息學(xué)分析手段獲得CsATP-synt_B基因，并對其結(jié)構(gòu)和功能進行了預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白不僅有常見的MTS，還有一段NLS BP，這是個比較罕見的現(xiàn)象。 2．成功構(gòu)建了重組原核表達載體pET-28a(+)-CsATP-synt_B<'30-300>，并表達純化CsATP-synt B<'30-000>蛋白。該蛋白具有良好的免疫原性，CsATP-synt B在華支睪吸蟲成蟲蟲體的分布比較廣泛

15、，幾乎遍布整個蟲體，其中腹吸盤、卵巢、卵黃腺和體表的熒光比較強，這四個部位也是華支睪吸蟲能量代謝比較旺盛的器官與組織。CsATP-synt_B在蟲體的分布與線粒體的分布較一致。 3．成功構(gòu)建了4個真核重組質(zhì)粒。pEGFP-N1-CsATP-synt_B<'1-300>在Hela細胞的線粒體和細胞核均有表達。這個結(jié)果證實了這兩段序列是介導(dǎo)蛋白質(zhì)進入線粒體和細胞核的靶向序列，說明了理論預(yù)測的正確性。細胞經(jīng)過同步化發(fā)現(xiàn)，融合蛋白是在G

16、l期進入細胞核的，其他細胞周期時點主要在線粒體表達。本課題首次發(fā)現(xiàn)并用實驗證實CsATP-synt B可以在G<,1>期進入細胞核。 4．細胞同步化后流式細胞檢測，空載體pEGFP-N1在Gd<,0>/G<,1>期表達量明顯下降，而pEGFP-N1-CsATP-synt_B<'1-300>在這個時期表達量是呈上升的趨勢。其他細胞周期時相，熒光表達量的變化趨勢相似。說明CsATP-synt_B可以裝配到宿主人的ATP合酶F0復(fù)合體

17、中發(fā)揮它的生物學(xué)作用，說明兩者在進化中的保守性。 5．在不同的細胞周期，半定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)融合蛋白進入細胞核后，目的基因CsATP-synt_B<'1-300>及HomoATP-synt B mRNA的表達均成上升趨勢，CsATP-synt_B<'1-300>上升幅度較大，但兩者的表達變化趨勢一致，說明融合蛋白進入細胞核是受細胞能量的需求和細胞周期的調(diào)控，并且對自身基因CsATP-synt_B<'1-300>的表達起正反