特發(fā)性高草酸尿癥模型大鼠肝組織的蛋白質組學研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：特發(fā)性高草酸尿癥大鼠模型肝組織二維電泳的可行性評價
　　 目的：在正式進行DIGE實驗前，需要進行二維電泳的可行性評價，并測試樣品的標記可行性，為熒光差異顯示凝膠電泳實驗的順利進行奠定實驗基礎。
　　 方法：選擇3只24小時尿草酸排泄量較高的特發(fā)性高草酸尿癥模型大鼠作為實驗組，選擇3只24小時尿草酸排泄量在正常范圍的SD大鼠作為對照組，切取其肝臟組織后分別提取總蛋白，然后利用雙

2、向電泳技術分離蛋白，掃描后獲得二維電泳的圖譜，并對提取的蛋白樣品進行熒光標記實驗。
　　 結果：總共獲得6張穩(wěn)定清晰的二維電泳圖譜和1張SDS-PAGE熒光標記實驗電泳圖譜。
　　 結論：由上述6張二維電泳圖譜來看,六個蛋白質樣品的蛋白質點的遷移基本穩(wěn)定正常，且各個蛋白提取液與DIGE熒光染料是兼容的，從而保證后續(xù)正式的DIGE實驗有較好的重復穩(wěn)定性和可行性。
　　 第二部分：特發(fā)性高草酸尿癥大鼠模型肝組織熒光差

3、異顯示雙向凝膠電泳
　　 目的：建立穩(wěn)定的特發(fā)性高草酸尿癥大鼠肝組織蛋白質組的熒光差異顯示雙向凝膠電泳圖譜，并對其進行差異蛋白質組的分析。
　　 方法：取特發(fā)性高草酸尿大鼠及正常對照大鼠的肝組織300mg，勻漿提取肝組織總蛋白，分別用Cy3或Cy5標記，每一對Cy3和Cy5標記樣品都與一個Cy2標記的內標等量混合，采用熒光差異顯示凝膠電泳（DIGE）技術進行電泳分離，經過不同激光下掃描得到不同樣品的蛋白質組圖譜。獲得的圖

4、譜經DeCyderTM v6.5軟件進行分析。
　　 結果：在特發(fā)性高草酸尿癥大鼠肝組織中共篩選出21個差異表達蛋白質點，有11個蛋白質表達水平顯著增加，另外10個蛋白質表達水平顯著下降。
　　 結論：利用DIGE技術可以作膠內對比分析，并可根據內標消除膠與膠之間的差異，從而提高統計可信度。分析出的21個差異蛋白質可能與特發(fā)性高草酸尿癥的發(fā)生有密切關系。
　　 第三部分：特發(fā)性高草酸尿癥大鼠模型肝組織差異表達蛋白

5、質的質譜鑒定
　　 目的：利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術（MALDI-TOF-MS）對特發(fā)性高草酸尿癥大鼠模型肝組織差異表達的蛋白質進行質譜分析和鑒定。
　　 方法：將熒光標記的雙向凝膠電泳凝膠圖與制備膠進行匹配后，在考染凝膠上找到相應的差異表達蛋白質點，選定要切的蛋白質點，經自動蛋白質點切割機切取，酶解后，利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術（MALDI-TOF-MS）對差異蛋白點進行鑒定，獲取PMF(p

6、eptidemass fingerprint)指紋圖譜,并在NCBI nr 20060526蛋白質數據庫中進行蛋白質匹配。
　　 結果：采用MALDI-TOF-MS質譜技術共對21個差異蛋白進行了鑒定，其中18個點找到與 PMF圖匹配的蛋白質。有一個下調蛋白質點689有PMF圖，但未在蛋白質庫中找到與之相匹配的蛋白質。這些蛋白質包括蛋白二硫化物異構酶A3（Pdia3）、乙醛脫氫酶（mitochondrial aldehyde d

7、ehydrogenase，ALDH）、rCG27878、兒茶酚-O-甲基轉移酶雙底物抑制復合體A鏈（Chain A，Catechol O-Methyltransferase Bisubstrate-Inhibitor Complex）等。
　　 結論：通過質譜鑒定篩選出的這些差異蛋白質可能參與了特發(fā)性高草酸尿癥的發(fā)生。在后期研究中，擬采用western 技術對特發(fā)性高草酸尿癥中這些差異蛋白進行檢測，而對未知蛋白的深入研究，也將有