白喉毒素無毒突變體CRM197介導大分子物質通過血腦屏障效果和機制的研究.pdf

1、目的：
　　 血腦屏障的存在極大的限制了大分子藥物通過血腦屏障進入腦組織,如何轉運大分子藥物通過血腦屏障是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療亟待解決的一個關鍵問題。
　　 目前研究表明,通過腦毛細血管內皮細胞上的內源性受體介導的藥物轉運可能是腦內藥物轉運最有效的方法之一。研究者們將藥物或基因轉移載體與一些內源性受體,如轉鐵蛋白或胰島素受體的單克隆抗體偶聯(lián)后,顯示出高效的腦內轉運效率。但由于上述單克隆抗體和體內的轉鐵蛋白、胰島素等內源性

2、配體能發(fā)生競爭性抑制作用,從而妨礙了腦組織攝取營養(yǎng)物質或藥物。最新研究表明,白喉毒素的無毒突變體--交叉反應物質197(cross-reacting material 197,CRM197)能夠與分布在腦毛細血管內皮細胞上的白喉毒素受體(diphtheria toxin receptor,DTR)結合,轉運大分子物質通過體外血腦屏障。由于CRM197作為莢膜多糖抗原載體蛋白或疫苗在國外已嘗試應用于臨床,而且在體內不存在與CRM197發(fā)生

3、競爭性抑制作用的內源性配體,提示CRM197有可能成為新的更為有效的腦內藥物轉運載體。
　　 藥物通過血腦屏障一般通過兩條途徑:即跨細胞途徑和細胞旁途徑。在跨細胞途徑中,質膜微囊蛋白caveolae依賴性跨細胞途徑在藥物通過血腦屏障的過程中起著重要的作用。Caveolin-1是caveolae的標志性蛋白,在維持caveolae的形態(tài)、結構和功能中起重要作用。研究表明,FOXO轉錄因子能夠直接與caveolin-1的啟動子區(qū)結合

4、,調節(jié)caveolin-1的表達。FOXO轉錄因子的活性受磷脂酰肌醇3激酶(phospatidyl-3-inositol-kinase,PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(v-akt routine thymomaviral oncogene homolog,Akt)磷酸化級聯(lián)通路的調節(jié),激活的Akt使FOXO發(fā)生磷酸化修飾導致轉錄失活。CRM197與DTR結合后可以抑制受體剪切,顯著減少肝素結合表皮生長因子(heparin-bindi

5、ng epidermal growth factor,HB-EGF)的形成,減弱由HB-EGF激活的PI3K/Akt等信號通路,進而可能參與對FOXO轉錄因子活性的調節(jié),上調cavcolin-1的表達。
　　 藥物通過血腦屏障的細胞旁途徑主要是通過調節(jié)ZO-1(zonula occluden-1)、occludin、claudin-5等緊密連接相關蛋白和粘附連接蛋白等結構,開放緊密連接,增加血腦屏障通透性。目前對于CRM197主

6、要通過何種途徑介導大分子物質通過血腦屏障的研究尚未見報道。
　　 本研究主要明確CRM197作用前后對體外和在體水平血腦屏障的通透性、跨細胞途徑和細胞旁途徑的影響,以及在此過程中PI3K/Akt/FOXO1A信號途徑是否參與對caveolin-1表達的調節(jié)。
　　 方法
　　 1、體外血腦屏障模型和CRM197-HRP(horseradish peroxidase)、BSA-HRP偶聯(lián)物的制備。
　　 2

7、、應用CRM197-HRP偶聯(lián)物與人腦微血管內皮細胞hCMEC/D3的結合實驗和跨細胞轉運實驗檢測CRM197-HRP的轉運效果。
　　 3、應用Millicell-ERS電阻測量系統(tǒng)檢測CRM197作用前后體外血腦屏障的跨內皮細胞電阻值(transendothelial electric resistance,TEER)的變化。
　　 4、應用伊文氏蘭(Evans blue,EB)滲透性評估CRM197作用前后豚鼠血腦

8、屏障通透性變化；透射電鏡觀察CRM197對腦微血管內皮細胞超微結構的影響。
　　 5、應用免疫組織化學法和免疫熒光法檢測CRM197作用前后p-Akt、p-FOXO1A和緊密連接相關蛋白ZO-1在hCMEC/D3細胞中的分布和表達水平的變化；以及caveolin-1和DTR在豚鼠腦微血管中的分布和表達水平的變化。
　　 6、應用RT-PCR法檢測CRM197作用前后hCMEC/D3細胞中caveolin-1 mRNA的表

9、達水平；應用western blot法檢測CRM197作用前后hCMEC/D3細胞和豚鼠腦微血管中caveolin-1、緊密連接相關蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的蛋白表達水平以及PI3K/Akt/FOXO1A信號通路活性的變化。
　　 結果
　　 1、成功建立了體外血腦屏障模型,獲得了CRM197-HRP偶聯(lián)物。
　　 2、CRM197-HRP與hCMEC/D3細胞的結合實驗表明CRM197

10、-HRP與hCMEC/D3細胞的結合水平呈時間依賴性增加,在60 min時達到最大值。
　　 3、CRM197能夠以劑量依賴的方式增加豚鼠血腦屏障的通透性,其中300μg/kg CRM197為開放血腦屏障的最適劑量。CRM197能夠增加腦微血管內皮細胞中吞飲小泡的數(shù)量,以300μg/kg劑量組增加最明顯。CRM197作用后,腦微血管中DTR的表達水平顯著減少。
　　 4、CRM197-HRP通過caveolae依賴性的跨

11、細胞途徑通過血腦屏障。Caveolin-1的mRNA和蛋白表達水平在CRM197作用后顯著增加,在30 min時達到峰值。
　　 5、CRM197作用后,hCMEC/D3細胞中Akt和FOXO1A的蛋白磷酸化水平均顯著下降,而總Akt的蛋白表達水平未發(fā)生變化；p-Akt在胞漿和胞核中的表達水平明顯減弱；FOXO1A在細胞核中的分布增加。
　　 6、CRM197作用60 min后,體外血腦屏障的TEER值顯著下降,hCME

12、C/D3細胞中緊密連接相關蛋白ZO-1在細胞膜上的表達減弱,而在胞漿中的表達明顯增強。CRM197作用60 min后,豚鼠腦微血管中ZO-1和occludin的蛋白表達水平均顯著減少。Claudin-5的蛋白表達水平在CRM197作用30 min時達到最低,而后增加。
　　 討論
　　 本研究證明,CRM197不僅能介導大分子物質HRP(40 kDa)有效通過腦微血管內皮細胞,而且能以劑量依賴的方式增加豚鼠血腦屏障的通透

13、性。CRM197作用后,腦微血管內皮細胞中吞飲小泡的數(shù)量增加。CRM197能夠通過caveolae依賴的跨細胞途徑增加血腦屏障通透性,這一過程伴有caveolin-1的mRNA和蛋白表達水平的增加,CRM197對PI3K/Akt信號途徑的抑制以及對FOXO1A活性的調節(jié)能夠參與對caveolin-1表達水平的調節(jié)。CRM197還能減少腦微血管中緊密連接相關蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表達,增加ZO-1在胞漿中的分

14、布,增加血腦屏障通透性。綜上所述,CRM197能夠通過caveolae依賴性的跨細胞途徑和細胞旁途徑介導大分子物質通過血腦屏障。
　　 由于不同種屬動物的細胞對CRM197的敏感性不同,人、猴、豚鼠等對CRM197敏感,而大鼠和小鼠不敏感。所以本研究主要以hCMEC/D3細胞和豚鼠為研究對象。我們首先采用hCMEC/D3細胞建立了體外血腦屏障模型,并以此為研究對象檢測了CRM197-HRP與hCMEC/D3細胞的特異性結合和內化

15、水平,證實了hCMEC/D3細胞對CRM197-HRP的攝取在5 min時開始增加,在60 min左右達到平衡。由于血漿中的白蛋白分子量較大(66 kDa),很難通過血腦屏障,經(jīng)常作為對照來評價體外或在體血腦屏障的通透性變化。本研究中,CRM197-HRP與hCMEC/D3細胞的結合水平約為BSA-HRP的兩倍,表明CRM197-HRP具有更好的內吞效果。在體外血腦屏障模型中,CRM197-HRP與hCMEC/D3細胞結合后從trans

16、well小室的上室到下室的轉運水平要顯著高于其從下室到上室的轉運水平,這種轉運方向的優(yōu)勢有助于轉運CRM197偶聯(lián)物進入腦組織。在體研究表明,CRM197能夠以劑量依賴的方式增加豚鼠血腦屏障的通透性,其中300μg/kg和500μg/kg劑量組間EB含量未見顯著差異?？紤]到臨床應用的安全性,我們采用300 μg/kg劑量作為開放血腦屏障的最適劑量。CRM197作用后腦微血管中吞飲小泡的數(shù)量增加,提示跨細胞途徑參與CRM197介導的轉運過

17、程。
　　 結論
　　 1、CRM197能夠以劑量依賴的方式增加血腦屏障通透性,300 μg/kg CRM197為開放血腦屏障的最適劑量,這一過程伴有腦微血管內皮細胞中吞飲小泡數(shù)量的增加。
　　 2、CRM197-HRP能有效通過體外血腦屏障,這一過程主要與caveolae依賴性的跨細胞途徑有關。
　　 3、CRM197能夠顯著抑制腦微血管內皮細胞中Akt和FOXO1A的磷酸化水平,增加FOXO1A在細胞