間質(zhì)干細胞受幽門螺桿菌影響對胃上皮細胞作用及機制.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:間質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一類分布廣泛且具有多向分化潛能的成體干細胞,能遷移到炎癥和損傷組織部位。幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, H.pylori)是慢性活動性胃炎和消化性潰瘍的重要病因,與胃癌的發(fā)生密切相關,H.pylori感染的胃腸道上皮細胞能促進MSCs向胃腸粘膜層募集。因此,MSCs是H.pylori感染所致胃炎微環(huán)境中的一種重要成份,然而在H.pylori

2、導致的胃上皮細胞損傷或惡性轉化中MSCs究竟起何作用及其機制迄今仍不清楚。
  因此,本研究旨在探討H.pylori對MSCs的影響及其對胃上皮細胞的作用及機制,試圖闡明MSCs參與H.pylori對胃損傷或胃癌發(fā)生、轉移及治療中的作用及機制,為胃癌發(fā)生與診療提供新的依據(jù)。
  方法:體外模擬體內(nèi)H.pylori(11637)感染過程,采用H.pylori(11637)活菌作為處理因素,與人臍帶來源的間質(zhì)干細胞(human

3、umbilical cord MSCs,hucMSCs))以感染指數(shù)100∶1共培養(yǎng)24h,觀察細胞形態(tài)變化,收集對照組及實驗組的細胞用于后面的實時定量PCR及蛋白免疫印跡檢測相關基因,并收集共培養(yǎng)的上清3000轉每分鐘,離心5min,將上清置-80℃貯存?zhèn)溆?。所有實驗均在同等條件下重復3次。分別用實時定量RT-PCR、Westernblot方法檢測H.pylori作用前后MSCs中癌相關成纖維細胞(cancer associated

4、fibroblasts,CAFs)相關標志分子(FAP、N-cadherin、Vimentin、α-SMA等)表達變化情況。采用Luminex及ELISA法檢測H.pylori作用hucMSCs后相關細胞因子的分泌情況。用Western blot法檢測H.pylori刺激培養(yǎng)后的hucMSC中NF-κB水平、NF-κB核轉位、磷酸化NF-κB及NF-κB抑制蛋白IκB-α的表達變化。應用NF-κB特異性抑制劑PDTC預處理MSCs90m

5、in,再用H.pylori刺激培養(yǎng)hucMSCs,觀察其是否能干預H.pylori對MSCs的刺激效應。采用MSCs培養(yǎng)上清及H.pylori與MSCs共培養(yǎng)的上清分別與正常胃上皮細胞(GES-1細胞)株共培養(yǎng)48h,觀察培養(yǎng)后的細胞形態(tài)變化,收集細胞并分別用實時定量RT-PCR和蛋白免疫印跡檢測共培養(yǎng)后胃上皮細胞/胃癌細胞中EMT相關標志分子如E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等的表達情況。采用Transwe

6、ll法檢測不同上清處理后的GES-1細胞其遷移能力的變化。用手工計數(shù)法和MTT法檢測正常胃上皮細胞GES-1在不同條件培養(yǎng)基處理后的生長曲線變化。應用平板克隆形成實驗檢測三種培養(yǎng)基處理過的GES-1細胞的克隆形成能力。流式細胞術和蛋白免疫印跡法分別檢測細胞凋亡與凋亡相關蛋白表達,同時檢測三種培養(yǎng)基處理過的GES-1細胞癌基因、抑癌基因及干性相關基因(Sox2、Nanog及BMI)的變化。應用NF-κB特異性抑制劑PDTC(10μM)預處

7、理MSCs90min,再用 H.pylori刺激培養(yǎng)hucMSCs,取其上清與GES-1細胞共培養(yǎng)48h作為實驗組,同時設立正常培養(yǎng)基和H.pylori刺激培養(yǎng)hucMSCs的上清再培養(yǎng)GES-1兩組,以觀察NF-κB參與MSCs轉化的同時,是否還參與轉化的間質(zhì)干細胞對胃上皮細胞的損傷作用。所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±SD方式表示,用SPSS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)作進一步分析,多組間比較可用單因素方差分析法分析,對照組與實驗組間兩兩比較用Student

8、't-t檢測,如數(shù)據(jù)不滿足方差齊,則采用Tamhane'T2方法進行結果校正。
  結果: H.pylori刺激后的MSCs細胞形態(tài)更傾向于細長,胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的空泡變性,有CAFs樣成纖維細胞變化的傾向。實時定量RT-PCR和Western blot結果顯示H.pylori作用24h后的MSCs中CAFs相關標志分子Vimentin、N-cadherin、α-SMA及FAP等均有不同程度的升高(P<0.05)。Luminex及EL

9、ISA法檢測H.pylori作用后的hucMSCs分泌大量細胞因子。H.pylori刺激的MSCs胞核中NF-κB含量升高,而胞質(zhì)中則下降,磷酸化的NF-κB在刺激組也是升高,存在時間依賴性,而NF-κB抑制蛋白IκB-α的表達下降。NF-κB特異性抑制劑PDTC抑制了H.pylori刺激的MSCs向CAFs樣成纖維細胞的轉化,同時還抑制了H.pylori刺激MSCs時分泌增加的一些因子的表達。H.pylori刺激培養(yǎng)的hucMSCs上

10、清作用于GES-1細胞48h后,光學顯微鏡下觀察到GES-1細胞形態(tài)較正常對照組變的細長如梭形,成纖維狀或紡錘形,細胞兩端尖細,細胞排列紊亂,部分細胞具有典型的間質(zhì)干細胞的表型,與EMT相關的間質(zhì)標志物N型鈣粘蛋白(N-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)等基因表達明顯上調(diào),而上皮標物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)基因表達明顯下降,這幾種分子的蛋白表達變化情況與mRNA變化趨勢一致。另外,結果還顯示體外經(jīng)H.pylor

11、i處理后的MSCs可以促使正常胃上皮細胞發(fā)生EMT,其遷移能力、克隆形成能力及相關干性指標(Sox2、Nanog和BMI)的表達均增強,凋亡相關基因的蛋白表達及原癌基因與抑癌基因之間的平衡也部分被打破。被H.pylori感染后轉化的間質(zhì)干細胞在促進胃上皮細胞發(fā)生EMT的同時,還使其獲得了部分在腫瘤細胞才能表現(xiàn)出來或典型表現(xiàn)的生物學特征或表型。采用H.pylori刺激PDTC預處理的hucMSCs上清并不能促使胃上皮細胞發(fā)生典型的EMT現(xiàn)

12、象。
  結論: H.pylori能促使MSCs向癌相關成纖維細胞樣細胞轉化,并伴有相應細胞因子的分泌。H.pylori對胃上皮細胞損傷或惡性轉化的方式之一,是通過誘使MSCs向CAFs樣轉化,再由CAFs樣轉化的成纖維細胞進一步發(fā)揮對胃上皮細胞的作用來實現(xiàn)的。H.pylori作用后的MSCs促進胃上皮細胞/胃癌細胞發(fā)生EMT,在腫瘤發(fā)生和進一步的惡性轉化過程中起重要作用,這一作用機制與NF-κB信號通路活化有關。
  本研

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