CLIC4參與上皮性卵巢癌腫瘤間質(zhì)相關成纖維細胞的轉化及其microRNAs調(diào)控.pdf

1、研究背景：
　　 卵巢癌是婦科腫瘤中致死率最高的惡性腫瘤，因為在其診斷時多數(shù)已為晚期病例，雖然經(jīng)過系統(tǒng)的手術、化學治療，5年生存率仍不超過45％，一直被認為是一個“沉默殺手”。越來越多的學者認識到，腫瘤的生物學行為不僅取決于腫瘤細胞本身的特征，而且與腫瘤間質(zhì)之間的相互作用密切相關。不同的實體腫瘤雖然實質(zhì)和間質(zhì)的比例不盡相同，但是一般腫瘤的間質(zhì)成分占整個實體腫瘤的50-90％。間質(zhì)成分毗鄰于腫瘤細胞，受到腫瘤細胞旁分泌信號的調(diào)節(jié)，

2、可以轉化為腫瘤相關的間質(zhì)細胞，因為其改變了細胞的表型、功能和腫瘤局部的微環(huán)境，可以促進腫瘤的增殖、浸潤、轉移和血管形成。腫瘤間質(zhì)的腫瘤相關纖維母細胞是間質(zhì)細胞中最主要的細胞成分，其主要來源包括：腫瘤局部的纖維母細胞、上皮間質(zhì)轉化、遠處部位的纖維母細胞、骨髓祖細胞、干細胞等。其中，間質(zhì)纖維母細胞是最主要的細胞成分，其不同于正常的纖維母細胞，因為表達已分化肌纖維母細胞表型標志α-SMA(α-smooth muscle actin)，被稱為腫

3、瘤相關成纖維細胞或肌纖維母細胞(tumour-associated fibroblasts，myofibroblasts)，但其分子轉化機制尚不完全清楚。對腫瘤相關成纖維細胞轉化激活機制的深入研究，將有助于靶向腫瘤間質(zhì)治療新策略的提出。
　　 細胞內(nèi)氯通道蛋白4(Chloride intracellular channel4，CLIC4)，是細胞內(nèi)的一種氯通道，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)pH值和細胞體積。它不僅存在于細胞器膜上，而且可以以可溶性

4、成分存在于細胞漿和細胞核內(nèi)，作為一種通道調(diào)節(jié)劑或信號蛋白。有研究顯示，TGF-β1可以刺激乳腺組織原位的纖維母細胞的CLIC4轉錄水平升高，更重要的是，CLIC4高表達于乳腺癌組織的間質(zhì)腫瘤相關成纖維細胞，而正常組織間質(zhì)中幾乎無CLIC4表達。故我們推測CLIC4可能參與上皮性卵巢癌的間質(zhì)肌纖維母細胞的轉化。
　　 MicroRNAs(miRNAs)是一類分布廣泛的小的非編碼蛋白質(zhì)的RNAs，其功能是負性調(diào)控基因表達。在人類基因

5、組中至少存在700個miRNAs(也有可能為1000個)，約占人類基因的1-4％，預測他們能夠調(diào)節(jié)至少三分之一的人類基因，這使得其成為最大的一類基因表達調(diào)控因子。miRNAs參與生命過程中幾乎所有的重要過程，包括早期發(fā)育，細胞增殖，細胞凋亡和細胞分化等。腫瘤間質(zhì)肌纖維母細胞轉化過程中存在一系列表型和功能基因的表達改變，但參與此過程調(diào)控基因表達的miRNAs尚未見報道。
　　 本研究中，我們首先檢測上皮性卵巢癌患者組織中CLIC4

6、的表達，并構建間質(zhì)肌纖維母細胞轉化的細胞模型，探討是否CLIC4參與此轉化過程及其在此過程中的作用，進一步探討調(diào)控腫瘤間質(zhì)肌纖維母細胞轉化的miRNAs。
　　 第一部分CLIC4介導卵巢癌腫瘤相關成纖維細胞轉化
　　 目的：
　　 來自腫瘤與間質(zhì)相互作用的信號分子激活腫瘤間質(zhì)肌纖維母細胞，其對腫瘤的進展起重要的作用。CLIC4可能參與間質(zhì)纖維母細胞的激活，但其分子機制尚不清楚。本研究擬探討CLIC4是否參與上皮

7、性卵巢癌間質(zhì)纖維母細胞向肌纖維母細胞的轉化及其在此過程中的作用。
　　 方法：
　　 1.應用免疫組織化學方法檢測上皮性卵巢癌組織間質(zhì)中CLIC4的表達。
　　 2.卵巢癌細胞條件培養(yǎng)基(Conditioned medium，CM)或轉化生長因子β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)培養(yǎng)原代卵巢正常纖維母細胞或人纖維母細胞系構建卵巢癌腫瘤間質(zhì)纖維母細胞向肌纖維母細胞轉化的

8、細胞模型，應用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變和肌纖維母細胞轉化細胞表型標志α-SMA表達上調(diào)，評價轉化細胞模型成功構建。
　　 3.應用肌纖維母細胞轉化的細胞模型，證實CLIC4和活性氧產(chǎn)物(reactive oxygen species，ROS)參與此轉化過程。
　　 4.應用CLIC4特異性siRNA阻斷CLIC4的表達，探討其在腫瘤間質(zhì)肌纖維母細胞轉化中的作用。
　　 5.應用CLIC4特異性siRNA阻斷C

9、LIC4的表達或氯離子通道抑制劑抑制CLIC4的功能、抗氧化劑阻斷ROS水平上調(diào)，探討它們對腫瘤間質(zhì)肌纖維母細胞轉化相關功能蛋白表達的抑制作用。
　　 結果：
　　 1.上皮性卵巢癌組織中間質(zhì)CLIC4的陽性表達率為97.22％，肌纖維母細胞表型標志物α-SMA的陽性表達率為94.44％，兩者密切相關性(P＜0.05)。腫瘤間質(zhì)CLIC4表達強度與患者的腫瘤分化程度和淋巴結轉移密切相關，中、低分化者，有淋巴結轉移者腫瘤組

10、織間質(zhì)CLIC4的表達明顯高于高分化，無淋巴結轉移者(P＜0.05)。
　　 2.應用卵巢癌細胞CM或TGF-β1培養(yǎng)卵巢組織原代正常纖維母細胞或人纖維母細胞系MRC-548小時，細胞增大呈多角形，而無血清培養(yǎng)的纖維母細胞呈細長紡錘狀，同時α-SMA的轉錄(P＜0.05)和蛋白表達水平顯著增加，表明正常纖維母細胞向肌纖維母細胞轉化。
　　 3.應用卵巢癌細胞CM或TGF-β1培養(yǎng)卵巢組織原代正常纖維母細胞或人纖維母細胞系

11、MRC-548小時，纖維母細胞CLIC4表達在轉錄(P＜0.05)和蛋白水平明顯上調(diào)。
　　 4.應用卵巢癌細胞CM或TGF-β1培養(yǎng)卵巢組織原代正常纖維母細胞或人纖維母細胞系MRC-5促進細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，應用抗氧化劑抑制ROS產(chǎn)生可以抑制CM或TGF-β1誘導的CLIC4和α-SMA上調(diào)(P＜0.05)。
　　 5.應用CLIC4特異性siRNA能夠有效阻斷CLIC4的表達，抑制CM或TGF-β1誘導的α-SMA表

12、達水平上調(diào)(P＜0.05)。
　　 6.應用CLIC4特異性siRNA阻斷CLIC4的表達或氯離子通道抑制劑抑制CLIC4的功能、抗氧化劑阻斷ROS水平上調(diào)，可以抑制與肌纖維母轉化相關促血管因子VEGFA和HGF mRNA水平表達29-80％(P＜0.05)。
　　 結論：
　　 CLIC4參與卵巢癌腫瘤間質(zhì)纖維母細胞向肌纖維母細胞轉化。來自腫瘤的旁分泌信號TGF-β1刺激使纖維母細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增加，進而促進C

13、LIC4的表達上調(diào)，最終導致纖維母細胞向肌纖維母細胞轉化，即腫瘤相關成纖維細胞的活化。阻斷CLIC4和ROS具有靶向腫瘤間質(zhì)的治療前景。
　　 第二部分microRNA-21參與腫瘤相關成纖維細胞轉化
　　 目的：
　　 腫瘤細胞分泌的TGF-β1誘導腫瘤間質(zhì)肌纖維母細胞的轉化表現(xiàn)為一系列表型和功能基因的表達改變。miRNAs作為重要的基因負性調(diào)節(jié)因子，目前參與腫瘤間質(zhì)肌纖維母細胞轉化的miRNAs尚未見報道。<

14、br>　　 方法：
　　 1.應用real time RT-PCR方法檢測一系列候選參與腫瘤間質(zhì)肌纖維母細胞轉化過程相關的miRNAs的表達水平。
　　 2.應用microRNA-21(miR-21)抑制物和類似物轉染人纖維母細胞，探討miRNA-21在腫瘤間質(zhì)肌纖維母細胞的轉化過程中的作用。
　　 3.應用計算機軟件預測腫瘤間質(zhì)成纖維細胞轉化過程中miR-21的靶向調(diào)控基因，應用構建包含miR-21靶基因調(diào)控

15、程序性細胞死亡4基因(programmed cell death4，PDCD4)3'-UTR的熒光素酶報告載體方法和應用轉染或敲除miR-21后檢測纖維母細胞中PDCD4表達水平的變化，確定PDCD4是否是miR-21在肌纖維母細胞轉化過程中的靶向調(diào)節(jié)基因。
　　 結果：
　　 1.應用卵巢癌細胞CM或TGF-β1培養(yǎng)人纖維母細胞系MRC-5，細胞內(nèi)miR-21表達水平上調(diào)(P＜0.05)，并且具有時間和劑量依賴性效應。

16、
　　 2.應用miR-21抑制物和類似物轉染纖維母細胞MRC-5，miR-21抑制物特異性降調(diào)而其類似物特異性上調(diào)miR-21的水平(P＜0.05)。miR-21抑制物可以抑制CM或TGF-β1誘導的腫瘤間質(zhì)肌纖維母細胞的轉化過程中α-SMA等轉化標志基因和功能基因的表達(P＜0.05)。
　　 3.生物信息軟件預測調(diào)控PDCD4的3'UTR與miR-21具有明顯的相互作用“種子序列”。
　　 4.構建含有mi

17、R-21潛在結合位點的PDCD4基因3'UTR熒光素酶報告載體，其與miR-21抑制劑或模仿劑共轉染入纖維母細胞MRC-5，miR-21模仿劑增加miR-21的表達而抑制熒光素酶活性，而miR-21抑制劑顯著增加熒光素酶活性(P＜0.05)。提示，在纖維細胞中miR-21能夠結合到PDCD4基因的3'UTR。
　　 5.應用特異性轉染或沉默方法，miR-21模仿劑和miR-21抑制劑分別降低和升高纖維母細胞中PDCD4的蛋白表達