長鏈非編碼RNA MALAT1調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響上皮性卵巢癌細胞遷移、侵襲功能的研究.pdf

1、研究目的:
　　研究長鏈非編碼RNAMALAT1基因?qū)θ松掀ば月殉舶┘毎w移與侵襲功能的影響，并探討MALAT1與上皮性卵巢癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系，為獲得卵巢癌治療新靶點提供更多的理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.采用qRT-PCR技術(shù)檢測四株人卵巢癌細胞株（HO-8910、A2780、OVCAR3和SKOV3）和45對人上皮性卵巢癌組織及正常卵巢組織中MALAT1mRNA的表達水平，篩選出相對高表達和相對低表

2、達MALAT1基因的細胞株用于后續(xù)實驗，并分析MALAT1mRNA表達水平與卵巢組織臨床病理資料之間的相關(guān)性；
　　2.合成特異性干擾MALAT1表達的shRNA，構(gòu)建慢病毒shRNA載體，測序驗證成功后，大量擴增慢病毒載體，在293T細胞內(nèi)進行慢病毒載體的大量包裝，經(jīng)濃縮純化后，測定慢病毒滴度，得到干擾慢病毒毒液和陰性對照慢病毒毒液，將病毒毒液感染OVCAR3細胞，結(jié)合熒光和嘌呤霉素藥物篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染該載體的OVCAR3細胞

3、株及其陰性對照細胞株，并運用qRT-PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染細胞株中MALAT1mRNA的表達；
　　3.體外瞬時轉(zhuǎn)染實驗：將pcDNA3.1(+)-MALAT1過表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SKOV3細胞，作為過表達實驗組；以pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SKOV3細胞，作為陰性對照組；并運用qRT-PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染24h、48h及72h后細胞中MALAT1mRNA的表達；
　　4.Transwell遷移與侵襲實驗：檢測MALAT1d的

4、表達對卵巢癌細胞遷移、侵襲功能的影響；
　　5.構(gòu)建裸鼠轉(zhuǎn)移瘤模型：將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MALAT1-shRNA的OVCAR3細胞經(jīng)裸鼠尾靜脈注射至第一組動物體內(nèi)，作為實驗組；將其陰性對照細胞同法注入第二組動物體內(nèi)，作為陰性對照組。兩組分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件均相同，記錄小鼠體重與攝食量變化。培養(yǎng)60天后，安樂死處理各組小鼠，解剖觀察各組小鼠肺部腫瘤轉(zhuǎn)移情況，并運用HE染色方法觀察組織形態(tài)學(xué)改變，以進一步證實腫瘤轉(zhuǎn)移；
　　6.探討MALA

5、T1促進卵巢癌細胞遷移、侵襲功能的分子機制：首先，用轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）刺激人上皮性卵巢癌細胞，通過WesternBlot實驗檢測E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表達，并運用qRT-PCR方法檢測MALAT1mRNA的表達；進一步地，用TGF-β1刺激人上皮性卵巢癌細胞的同時，分別上調(diào)和下調(diào)MALAT1基因的表達，采用WesternBlot方法檢測E-cadherin、N-cadherin、

6、Vimentin蛋白的表達，同時檢測轉(zhuǎn)錄因子Snail蛋白的表達；
　　7.統(tǒng)計學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以??±s表示。樣本之間的差異比較：兩組數(shù)據(jù)間的比較采用Student’st檢驗和卡方檢驗的Fisher確切概率法；多組數(shù)據(jù)間的比較采用方差分析和LSD檢驗；相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析方法；檢驗水準為α＝0.05，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:<

7、br>　　1.MALAT1mRNA在上皮性卵巢癌組織中的表達顯著高于正常卵巢上皮組織（p<0.05）,其表達水平與卵巢癌的FIGO分期成正相關(guān)（r=0.807，p<0.000），而與患病年齡、組織學(xué)類型、分化程度、是否伴有腹水轉(zhuǎn)移等無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)（p>0.05）；
　　2.MALAT1mRNA在四株上皮性卵巢癌細胞中均有表達，其中在OVCAR3細胞中表達相對最高，在SKOV3細胞中表達相對最低（p<0.05）；
　　3.上調(diào)M

8、ALAT1基因的表達，可促進上皮性卵巢癌細胞株SKOV3的遷移與侵襲能力（p<0.05），而下調(diào)MALAT1的表達顯著抑制卵巢癌細胞株OVCAR3的遷移與侵襲能力（p<0.05）；
　　4.裸鼠轉(zhuǎn)移瘤模型實驗：實驗過程中，兩組小鼠之間的體重與攝食量差異，無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05），而肺部重量，NC組顯著大于實驗組（p<0.05）；解剖發(fā)現(xiàn)：陰性對照組中，有5只小鼠肺臟均可見明顯腫瘤病灶，1只小鼠肺部未見明顯異常（另有2只小鼠于實

9、驗結(jié)束前意外死亡），而實驗組中8只小鼠肺部中均未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的腫瘤轉(zhuǎn)移灶。HE染色：陰性對照組肺部轉(zhuǎn)移灶組織可見較多異質(zhì)性腫瘤細胞圍繞支氣管和血管周圍，而實驗組肺臟未見明顯異常；
　　5.用TGF-β1刺激卵巢癌細胞后，WesternBlot結(jié)果顯示：E-cadherin蛋白表達下調(diào)，而N-cadherin、Vimentin蛋白表達均上調(diào)（p<0.05）,同時qRT-PCR結(jié)果顯示MALAT1mRNA表達受到上調(diào)（p<0.05）；

10、用TGF-β1刺激卵巢癌細胞的同時上調(diào)MALAT1的表達，WesternBlot結(jié)果顯示：E-cadherin蛋白表達進一步減弱，而N-cadherin、Vimentin蛋白表達均繼續(xù)加強，同時發(fā)現(xiàn)Snail蛋白表達增加（p<0.05）；互補實驗中，下調(diào)MALAT1的表達，可上調(diào)E-cadherin蛋白的表達，而N-cadherin和vimentin蛋白的表達相對減弱，同時伴有Snail蛋白表達減弱（p<0.05）。
　　研究結(jié)論

11、:
　　1.長鏈非編碼RNAMALAT1在人上皮性卵巢癌組織中異常高表達，且其表達與卵巢癌的FIGO分期成正相關(guān)，提示MALAT1可能參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程；
　　2.從體內(nèi)體外兩個層面證實：上調(diào)MALAT1基因的表達，可顯著促進卵巢癌細胞的遷移與侵襲能力，提示MALAT1可能參與卵巢癌的轉(zhuǎn)移過程；
　　3.TGF-β1可誘導(dǎo)卵巢癌細胞發(fā)生EMT，同時上調(diào)了細胞中MALAT1基因的表達；MALAT1可調(diào)控卵巢癌細胞發(fā)