中國人群HIV-1特異性CD8+T細胞應答免疫優(yōu)勢表位的篩選鑒定.pdf

1、目前獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）已成為嚴重危害全人類健康的傳染病之一。高效抗逆轉錄病毒療法能夠抑制HIV-1復制，使CD4細胞數量增加，在抗HIV-1感染中取得了一定效果。然而由于這些抗病毒藥物價格昂貴、毒副作用大、易產生HIV-1耐藥株以及患者依從性不好影響了抗病毒治療的效果。因此最終需要一種有效的疫苗來控制HIV-1的流行和傳播。大量研究表明細胞毒性T細胞（CTL）應答在控制HIV-1中發(fā)揮重要作用。因而誘導強烈的CTL應答成為

2、HIV-1疫苗需要考慮的重要因素之一。
　　本研究選擇中國大陸HIV-1感染者為研究對象，采用酶聯免疫斑點吸附試驗（ELISpot）檢測覆蓋HIV-1B、C亞型全基因序列肽段誘導的CTL應答反應，分析中國HIV-1感染者HIV-1特異性CTL應答特征；并進一步篩選鑒定一批CTL免疫優(yōu)勢表位。為適合中國人群的HIV-1候選疫苗設計和實驗研究提供理論依據。
　　主要研究內容和結果如下：
　　1.在對109例HIV-1感染者

3、B亞型特異性CTL應答檢測后發(fā)現，413條肽段中382條（92.5％）能夠被至少一個HIV-1感染者體內T細胞識別產生應答。識別頻率居前4位的肽段均出自Nef蛋白。Gag-p24和Nef無論是識別頻率還是應答強度均為最高的蛋白亞單位。相反，Vpu是最低的蛋白單位。
　　2.將HIV-1感染者按照CD4細胞計數劃分為CD4<200/μl組，200/μl400/μl組。將三組的CTL應答進行比較發(fā)現，

4、CD4<200/μl的HIV-1感染者特異性CTL應答不論是應答強度還是廣度都顯著低于其他兩個組。細致分析發(fā)現CD4>400/μl組對Gag，Pol和Rev蛋白的應答廣度和強度顯著高于CD4<200/μl（p=0.004和0.034；p=0.026和0.005；p=0.024和p=0.025）。針對Gag應答水平的下降主要是由于Gag-p24和p15誘導的CTL應答的下降。而針對Pol應答水平的下降則與其三個亞單位（RT，Pro和IN）

5、都有關。另外，針對gp120，Vpr和Vif三個蛋白亞單位最強的特異性CTL應答出現在200/μl

6、L應答與病毒載量存在微弱的負相關關系（p=0.031和0.035）。
　　3.比較了HIV-1B、C兩個亞型全基因序列肽庫誘導的CTL應答后發(fā)現，HIV-1B亞型感染者對兩個亞型肽段的應答強度和識別肽段數量均無顯著差異。將肽段按照被識別能力分為單獨識別組和交叉識別組，分別進行Shannon熵值計算，結果顯示不同亞型間能夠被交叉識別的肽段優(yōu)先出現在具有亞型熵值更低和組間同源性更高的病毒序列區(qū)域（p=0.039和0.018）。

7、　　4.確定25個重疊肽段為免疫優(yōu)勢區(qū)，進一步切割成長度為12個氨基酸的短肽，ELISpot篩選出10個含候選表位的序列。用細胞內細胞因子染色技術（ICS）通過效應細胞（PBMC）與靶細胞（B-LCL）攜帶HLA-I類分子間匹配關系確定誘導CTL應答效應的表位HLA-I類等位基因限制性。結果顯示NEF-C-10肽段RPQVPLRPMTFK（RK12）由HLA-Cw04等位基因限制；VPR-B-2肽段GPQREPYNEWTL（GL12）和

8、GAG-B-13肽段HQRIEIKDTKEAL（HL13）由HLA-B40所限制；NEF-C-27肽段HMARELHPEFY（HY11），NEF-C-17肽段QGYFPDWQNYTP（QP12）和POL-C-85肽段QKTELQAIYLAL（QL12）由HLA-Cw07所限制；NEF-C-15肽段KKRQEILDLWVY（KY12）和GAG-C-46肽段RALGPGASLEEM（RM12）由HLA-A02所限制；ENV-C-76肽段QQ

9、HLLQLTVWGI（QI12）由HLA-Cw06所限制；NEF-C-27肽段RELHPEFYKDC（RC11）由HLA-A11所限制。
　　5.對12個氨基酸肽段進行計算機表位預測。根據預測結果合成候選表位，以及4條在候選表位兩端各或加或減一個氨基酸的肽段。通過濃度稀釋法再次用ELISpot實驗測定表位親和力，確定最佳表位。本研究共確定10個最佳表位，分別為RPQVPLRPM（RM9），REPYNEWTL（RL9），ARELHP

10、EF（AF8），ARELHPEFYK（AK10），QGYFPDWQNY（QY10），RQEILDLWVY（RY10），IEIKDTKEAL（IL10），RALGPGASL（RL9），QKTELQAIY（QY9）和QQHLLQLTV（QV9）。
　　6.對10個新鑒定表位應答頻率檢測后發(fā)現，不同表位在表達特定HLA-I類等位基因的HIV-1感染者中應答頻率差異顯著。應答頻率最高的是HLA-Cw04限制的表位RM9（50％）。在對該表