MTB Ag85B199-207和HIV-1 Env120-128雙特異TCR基因修飾CD8+T細胞及其活性研究.pdf

1、結核病和人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type1，HIV-1)感染是全球最致命的慢性感染疾病。結核是HIV感染者發(fā)病率和死亡率升高的主要原因，也更容易在HIV感染人群中進行播散。據WHO統(tǒng)計報告，2013年全球新增結核病人900萬，其中110萬(13％)共感染HIV;全球結核死亡人數150萬，其中1/4為合并感染HIV致死。在宿主中，結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberc

2、ulosis，MTB）和HIV彼此加強相互作用，加快免疫功能的弱化或喪失。結核潛伏感染者，一旦再感染HIV，會加速破壞機體免疫系統(tǒng)，主要使CD4+T淋巴細胞的功能下降和數量減少，激活原本受抑制的MTB，使之更容易發(fā)展成活動性結核。同時，MTB通過刺激單核細胞和巨噬細胞大量分泌單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）促進HIV的轉錄，加速病毒增殖，促使病情惡化。目前，MTB/H

3、IV雙重感染者的治療主要是異煙肼預防治療與抗逆轉錄病毒治療的結合，其療程長，多種藥物相互作用，藥物重疊的毒副作用大，易產生耐藥性，病人服藥依從性差，對這兩種疾病同時有效的藥物稀缺，整合異煙肼預防治療與抗逆轉錄病毒治療存在時間和藥物選擇的巨大挑戰(zhàn)，以及出現免疫重建炎癥綜合癥等問題。因此，亟需開發(fā)針對MTB/HIV共感染行之有效的治療方法。
　　抗MTB/HIV共感染的主要免疫機制是以T細胞介導的細胞免疫為主。已有大量實驗證據表明，抗

4、原特異性CD8+T細胞在控制MTB和HIV感染中發(fā)揮著至關重要的作用。效應CD8+T細胞通過以下兩種途徑來發(fā)揮作用:1）發(fā)揮細胞毒作用，通過穿孔素和顆粒酶B(granzyme B，GrB)途徑直接殺傷感染靶細胞;2）釋放Th1型細胞因子，如干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），抑制病原體復制，促進巨噬細胞清除胞內病原體。然而，在MTB/HIV共

5、感染者體內，其免疫功能明顯紊亂，表現為T細胞增殖反應下降，效應CD8+T細胞數量和反應水平均很低，白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）和IFN-γ產生顯著減少。因此，通過過繼轉移大量效應CD8+T細胞至MTB/HIV共感染者體內，可增強其抗MTB/HIV感染的能力。
　　過繼細胞免疫治療已在抗MTB和HIV感染中顯示了巨大潛力。Kitsukawa等利用滅活的結核菌體外致敏PBL，將其回輸給多藥耐藥肺結核患者，取得

6、良好療效。Lieberman等將患者自體HIV特異性CD8+細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxie T lymphocyte，CTL)過繼回輸治療6例HIV感染者，最初2周所有患者CD4計數增加，5名患者血漿病毒血癥減少。24周后，2名患者的HIV病毒負載繼續(xù)減少，另1名患者CD4計數增加超過2倍。盡管過繼細胞免疫治療展現出光明的前景，但這種方法的廣泛應用卻存在許多障礙。
　　有研究者提出，在人初始T細胞池中，不同特異性的TCR種

7、類＜108，而潛在外源肽＞1015，因此，TCR的數量與大量潛在的外源肽-MHC復合物相比，是相形見絀的。適應性T細胞免疫要求每個T細胞都能識別大量與細胞異常相關的潛在抗原肽，這種現象可以由T細胞的交叉反應性來解釋。最近報道的從Ⅰ型糖尿病患者分離的1E6 TCR具有非常大的交叉反應性。表達1E6 TCR的T細胞除了識別前胰島素原來源的HLA-A*0201限制性PPI15-24肽（ALWGPDPAAA）以外，還至少對130萬個十肽產生反應

8、，反應強度與PPI15-24一樣強烈。在這些大量肽中，活化表達1E6 TCR的T細胞時，RQFGPDFPTI比PPI15-24的活性強100倍以上，盡管它與PPI15-24在組成上有七個氨基酸不一致。因此，我們完全有理由相信可以找到一個單一TCR同時識別兩種抗原肽。
　　目的:
　　本文首次提出通過轉導一個TCR同時產生針對兩種不相似病原體抗原肽的活性反應，為MTB/HIV共感染患者的免疫治療提供新的思路。利用分別負載MTB

9、肽Ag85B199-207(KLVANNTRL)和HIV-1肽Env120-128(KLTPLCVTL)的樹突狀細胞(dendritic cell,DC)反復刺激HLA-A*0201型健康人外周血CD8+T細胞，通過互補決定區(qū)3（complementarity determining region3，CDR3）譜型分析，篩選出同時對Ag85B199-207和Env120-128特異的單一TCR，通過逆轉錄病毒載體將雙特異TCR基因轉導至

10、普通CD8+T細胞中使其表達。研究結果顯示，雙特異TCR基因修飾的CD8+T細胞既可針對Ag85B199-207產生高水平的IFN-γ、TNF-α和GrB分泌及特異性殺傷，同時也可針對Env120-128產生顯著的效應反應。本研究為MTB/HIV共感染過繼細胞免疫治療奠定了基礎，同時也為其他共感染疾病的免疫治療研究提供了模式和平臺。
　　方法:
　　1.篩選Ag85B199-207和Env120-128雙特異TCR
　

11、　1)采用淋巴細胞分離液分離HLA-A*0201型健康志愿者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC);
　　2)PBMC貼壁培養(yǎng)2h后，吸出懸浮細胞，往貼壁細胞中加入100 ng/mL重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(recombinant human granulocytemacrophage colony-stimulating factor, rhGM-CSF)和10

12、0 ng/mL重組人白細胞介素-4（recombinant human interleukin-4，rhIL-4）誘導DC;
　　3)MTB肽Ag85B199-207（50μg/mL）和HIV-1肽Env120-128（50μg/mL）分別沖擊致敏DC;
　　2.重組逆轉錄病毒載體構建與病毒滴度測定
　　1)根據NCBI網站GeneBank報道的人TCRα、β基因家族上游可變區(qū)(variableregion，V)和下游

13、恒定區(qū)(constant region，C)基因序列，設計TCRα和β鏈全長基因上、下游引物，擴增出Ag85B199-207和Env120-128雙特異的α17和β15基因;
　　2)根據文獻報道的影響外源TCR基因表達和功能的C區(qū)9個關鍵氨基酸序列，分別設計α和β鏈C區(qū)突變位點上、下游引物，利用重組PCR方法將TCRα、β鏈C區(qū)9個關鍵氨基酸進行替換;
　　3)利用重組PCR技術，將TCRα和β基因通過自剪切多肽P2A連接

14、，測序鑒定正確后插入逆轉錄病毒載體pMX-IRES-GFP，酶切鑒定;
　　結果:
　　1.分析抗原肽刺激前后CDR3譜型，篩選出MTB肽Ag85B199-207和HIV-1肽Env120-128雙特異TCR
　　通過對CDR3譜型進行分析發(fā)現，抗原肽刺激前健康志愿者外周血T細胞各TCR Vα（αchain variable gene）、Vβ(β chain variable gene)基因家族CDR3譜型均呈8個或8

15、個以上峰型的高斯分布，表現為多克隆性。
　　2.構建重組逆轉錄病毒表達載體
　　成功擴增出MTB肽Ag85B199-207和HIV-1肽Env120-128雙特異的α17和β15全長基因片段，將其克隆至pGEM-T載體后測序鑒定，其V、C區(qū)DNA序列與GeneBank報道的序列完全一致。利用重組PCR技術，將人Cα、Cβ區(qū)9個關鍵位點的氨基酸替換為鼠C區(qū)相應位點氨基酸，擴增出hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα融合基因

16、，將其插入pMX-IRES-GFP載體，構建重組逆轉錄病毒表達質粒pMX-hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα-IRES-GFP，酶切鑒定證實基因片段插入正確。
　　結論:
　　本研究利用分別負載MTB肽Ag85B199-207和HIV-1肽Env120-128的DC反復刺激HLA-A*0201型健康志愿者外周血CD8+T細胞，通過CDR3譜型分析，獲得針對這兩種抗原肽共同特異的單個TCR。通過逆轉錄病毒載體pMX-I

17、RES-GFP介導，將該雙特異TCR轉導至初始CD8+T細胞，人為賦予其識別特異性抗原的能力。由于外源性TCRα、β鏈可能與內源性TCRα、β鏈發(fā)生錯配，因此，為了減少錯配機率，同時增加外源性TCR的表達和功能，我們對雙特異TCR進行最小突變，即將人C區(qū)9個關鍵位點氨基酸替換為鼠C區(qū)相應位點氨基酸。我們將最小突變的雙特異TCR基因轉導自體CD8+T細胞并檢測其活性，結果表明該TCR基因修飾的CD8+T細胞具有雙特異性，既可針對MTB肽A