VCAM-1修飾人臍血基質(zhì)細(xì)胞對造血干-祖細(xì)胞擴增的實驗研究.pdf

1、造血微環(huán)境(hematopoieticinductivemicroenvironment，HIM)是造血干/祖細(xì)胞定殖、分化、發(fā)育和成熟的場所，基質(zhì)細(xì)胞作為造血微環(huán)境中的重要成分，不僅與造血細(xì)胞的自我更新、增殖分化及歸巢定位密切相關(guān)，而且在血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中也具有非常重要的作用。因此深入探討基質(zhì)細(xì)胞對造血的影響，對血液學(xué)的研究和發(fā)展十分重要。目前對基質(zhì)細(xì)胞的研究主要集中在骨髓基質(zhì)細(xì)胞方面，有關(guān)臍血基質(zhì)細(xì)胞及臍血相關(guān)造血

2、微環(huán)境生物學(xué)特性的研究報道較少。臍血中的造血干細(xì)胞較外周血和骨髓更原始，具有來源廣泛，采集方便，GVHD輕，高增殖和長期造血重建的特點，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。本科室前期工作證實，臍血中存在基質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞，并能通過特定的細(xì)胞因子組合使臍血基質(zhì)細(xì)胞得以有效擴增；擴增后的臍血基質(zhì)細(xì)胞能夠分泌表達(dá)GM-CSF、TPO、SCF等多種細(xì)胞因子。 基于以上分析，本課題擬對臍血基質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行進(jìn)一步研究；同時構(gòu)建VCAM-1-pc

3、DNA3.1(+)真核表達(dá)載體，并對VCAM-1修飾的人臍血基質(zhì)細(xì)胞調(diào)控造血的作用進(jìn)行初步的探討。 一、本研究的主要內(nèi)容和研究方法如下：1.應(yīng)用人臍血CD34+細(xì)胞，采用DEXTER基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系行臍血基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，采用細(xì)胞化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)對臍血基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞組成進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，初步探討臍血基質(zhì)細(xì)胞傳代培養(yǎng)的條件和方法。 2.比較臍血CD34+細(xì)胞在細(xì)胞因子存在和/或臍血基質(zhì)細(xì)胞支持條件下，體外擴增能力的異同，并對不

4、同條件下擴增的細(xì)胞進(jìn)行CFU-GM、CFU-E、CFU-MG半固體培養(yǎng)，探討臍血基質(zhì)細(xì)胞在造血細(xì)胞體外擴增研究中可能的應(yīng)用價值。 3.采用半巢式RT-PCR從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中獲取VCAM-1基因，并將其定向克隆到PCDNA3.1(+)真核表達(dá)載體中，構(gòu)建VCAM-1-PCDNA3.1(+)真核表達(dá)載體。 4.脂質(zhì)體介導(dǎo)VCAM-1-PCDNA3.1(+)真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人臍血基質(zhì)細(xì)胞，半定量RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)分

5、別從MRNA和蛋白質(zhì)水平檢測轉(zhuǎn)染前/后HUCBSCVCAM-1表達(dá)情況。 5.在第一部分實驗的基礎(chǔ)上，增加VCAM-1修飾HUCBSC滋養(yǎng)層組(V組)和細(xì)胞因子聯(lián)合VCAM-1修飾HUCBSC滋養(yǎng)層組(F+V組)，比較臍血CD34+細(xì)胞在上述條件下體外擴增能力的異同，并對不同條件下擴增的造血細(xì)胞進(jìn)行CFU-GM、CFU-E、CFU-MG半固體培養(yǎng)，初步探討VCAM-1修飾的臍血基質(zhì)細(xì)胞在造血調(diào)控方面的作用和意義。 二、實

6、驗結(jié)果如下：1.人臍血基質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征及鑒定：擴增后的人臍血基質(zhì)細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上主要包括三種不同類型的細(xì)胞成分：①“成纖維樣”細(xì)胞；②“巨噬樣”細(xì)胞；③“小圓樣”細(xì)胞。細(xì)胞化學(xué)提示糖原強陽性，陽性率100％；堿性磷酸酶部分陽性，陽性率26％。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示：CD68呈強陽性，陽性率93％；CD31陽性率95％；Fn陽性率98％；CD34呈陰性。 2.人臍血基質(zhì)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：本實驗在細(xì)胞生長達(dá)80％融合時即開始傳代，培養(yǎng)基和

7、培養(yǎng)條件不變，為保證接種細(xì)胞密度，采取1：1的比例傳入同等容量的培養(yǎng)瓶中。隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于一致，以“成纖維樣”細(xì)胞為主，“小圓樣”細(xì)胞和“巨噬樣”細(xì)胞明顯減少，成功傳至第4代。 3.人臍血基質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞體外擴增的作用：以hUCBSC為滋養(yǎng)層的擴增體系能夠?qū)δ氀狢D34+細(xì)胞進(jìn)行有效擴增；其中，以細(xì)胞因子聯(lián)合hUCBSC對CD34+細(xì)胞的擴增作用最佳(P＜0.05)，短期擴增后的臍血CD34+細(xì)胞形

8、成的CFU-GM、CFU-E和CFU-Mg顯著高于未擴增對照組(P＜0.05)。此外，以hUCBSC為滋養(yǎng)層擴增后的臍血CD34+細(xì)胞，其CFU-Mg集落的形成能力明顯高于未擴增組和單獨的細(xì)胞因子組(P＜0.05)。 4.VCAM-1-pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體的構(gòu)建：采用半巢式RT-PCR法從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUV-EC-C中分三段克隆得到VCAM-1CDNA片段1、2、3；應(yīng)用基因重疊延伸技術(shù)(SPICEDBYOVE

9、RLAPPINGEXTENSION，SOE)分別將片段1、2連接成片段4，片段2、3連接成片段5，并分別亞克隆至PMD18-T載體中，測序修復(fù)后，定向克隆至PCDNA3.1(+)真核表達(dá)載體中，構(gòu)建VCAM-1-PCDNA3.1(+)真核表達(dá)載體；測序證實與GENBANK中序列一致，定向構(gòu)建的VCAM-1-PCDNA3.1(+)真核表達(dá)載體連接方向、閱讀框正確，表明載體構(gòu)建成功。 5.脂質(zhì)體介導(dǎo)VCAM-1-PCDNA3.1(+

10、)真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人臍血基質(zhì)細(xì)胞及陽性克隆的鑒定：脂質(zhì)體介導(dǎo)重組載體轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)人臍血基質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，7天后可見有陽性克隆形成。與轉(zhuǎn)染前相比，轉(zhuǎn)染后的原代培養(yǎng)的HUCBSC呈片狀生長，數(shù)量有所減少，細(xì)胞體積稍增大、形態(tài)仍以“成纖維樣”細(xì)胞、“巨噬樣”細(xì)胞和“小圓樣”細(xì)胞為主；陰性對照組經(jīng)G418篩選后死亡。提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組DNA，PCR鑒定NEOR基因存在，證實載體基因已成功轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)中。 6.轉(zhuǎn)染前/后VCAM-

11、1基因在人臍血基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)情況的檢測：采用半定量RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)分別從MRNA和蛋白質(zhì)兩個不同的水平進(jìn)行檢測。其中，半定量RT-PCR以B-ACTIN作為內(nèi)參，免疫細(xì)胞化學(xué)陽性細(xì)胞以百分比表示，達(dá)到半定量檢測的目的，結(jié)果提示轉(zhuǎn)染后人臍血基質(zhì)細(xì)胞VCAM-1的表達(dá)較轉(zhuǎn)染前明顯增高(P＜0.05)。 7.VCAM-1修飾人臍血基質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞體外擴增的作用：在第一部分實驗的基礎(chǔ)上，增加VCAM-1修飾hUCBS

12、C滋養(yǎng)層組(V組)和細(xì)胞因子聯(lián)合VCAM-1修飾hUCBSC滋養(yǎng)層組(F+V組)對造血細(xì)胞進(jìn)行體外擴增，結(jié)果顯示VCAM-1修飾的人臍血基質(zhì)細(xì)胞能夠有效支持臍血CD34+細(xì)胞的體外擴增(P＜0.01)，其中對CFU-Mg的擴增作用強于未轉(zhuǎn)染組(S組，P＜0.05)。 三、研究得出以下結(jié)論：1.人臍血基質(zhì)細(xì)胞具有造血基質(zhì)細(xì)胞的基本特征； 2.原代培養(yǎng)的人臍血基質(zhì)細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)，傳代后細(xì)胞形態(tài)趨于一致，以“成纖維樣”細(xì)胞為

13、主，在本實驗條件下可傳至第4代； 3.人臍血基質(zhì)細(xì)胞具有促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞體外擴增的能力，與細(xì)胞因子聯(lián)合促進(jìn)作用更加明顯，對巨核細(xì)胞集落生成的促進(jìn)作用尤為顯著； 4.本研究構(gòu)建的VCAM-1-pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體可在轉(zhuǎn)染的人臍血基質(zhì)細(xì)胞中檢測到NeoR基因，并且可使VCAM-1表達(dá)增高，表明VCAM-1基因高表達(dá)體系構(gòu)建成功； 5.VCAM-1修飾的人臍血基質(zhì)細(xì)胞對造血干/祖細(xì)胞體外擴增具有明顯促進(jìn)