骨髓間質干細胞移植抑制心肌梗死大鼠心肌間質纖維化的作用研究.pdf

1、心肌梗死(myocardial infarction，MI)是嚴重威脅人類健康和生命的常見病之一。在心肌梗死急性期，梗死區(qū)心肌呈凝固性壞死，心肌間質充血、水腫，伴多量炎癥細胞浸潤。急性期過后，壞死的心肌逐漸被纖維組織替代，而非壞死區(qū)心肌間質也因神經內分泌的影響發(fā)生重構致使心臟的收縮和舒張功能受損并最終導致心力衰竭。 心肌梗死后期出現(xiàn)心室重構的主要原因是心肌纖維化的形成。由于機械應力作用、缺血性刺激、反應性活性氧的作用及自我放大途

2、徑導致了心肌梗死后TNF-α，TGF-β及IL-6等炎癥因子大量生成。而大量的炎癥因子又通過刺激原位成纖維細胞的增殖，使得心肌間質組織成纖維細胞數(shù)量大量擴增，大量Ⅰ、Ⅲ型膠原合成并沉積于心肌間質組織，導致心肌間質纖維化，心室擴張，致使心臟的收縮和舒張功能受損，最終導致遠期心力衰竭，患者的生活質量下降、勞動力喪失，甚至危及生命。 及時有效的藥物或介入治療可顯著降低急性心肌梗死病死率。然而，無論是藥物溶栓治療還是介入再通治療，均只能

3、改善梗死區(qū)心肌血供，卻無法逆轉已經壞死的心肌細胞，難以抑制心肌梗死后的炎癥反應及心肌纖維化進展。骨髓來源間充質干細胞(bone marrow derived meserlchymal stem cells，BMSCs)具有良好的增殖及多向分化潛能，且具有一定的抗炎癥和抗組織纖維化作用。大量的研究報道指出BMSCs移植治療心肌梗死模型動物可以通過橫向分化或細胞融合的方式起到一定的治療效果。然而，BMSCs在梗死心肌局部分化為成熟心肌細胞效

4、率非常低，且分化后的心肌細胞是否具有功能還需進一步證實。已有報道指出BMSCs能抑制肺、腎、肝等器官組織纖維化及炎癥反應。因此，雖然BMSCs在心肌梗死局部分化心肌細胞能力有限而限制了其替代治療作用，但如果能有效抑制心肌梗死后期心臟間質纖維化，則可有效延緩心肌梗死后期的病變，并能在一定程度上改善患者的愈后生活質量。 為了解BMSCs是否具有抑制心肌梗死后期心臟間質纖維化的作用。本研究通過體外分離擴增大鼠BMSCs，并進行成脂成骨

5、誘導分化，確定其多向分化潛能；同時制作SD大鼠心肌梗死模型，并于模型制作后24小時經尾靜脈移植同種異體BMSCs，觀察細胞移植后心梗模型鼠的心功能，檢測模型鼠心肌TGF-β、FNF-α mRNA表達水平和Ⅰ、Ⅲ型膠原表達情況，并分別與未治療組模型鼠進行比較，為今后的臨床治療試驗提供試驗依據(jù)。 1材料和方法： 1.1試驗材料1.1.1試驗動物實驗動物分3組：正常對照組、模型對照組、BMSCs治療組。模型對照組和BMSCs治

6、療組大鼠于MI后24小時分別給予生理鹽水和BMSCs細胞懸液治療，并于治療后3天、7天、21天處死。沿心臟縱軸切開心臟標本，部分組織用于提取RNA，另一部分組織用于石蠟包埋和切片。 1.1.2試驗試劑與器材(略)1.2試驗方法1.2.1大鼠BMSCs分離、培養(yǎng)、鑒定采用差速貼壁法分離、擴增及純化SD鼠BMSCs并進行表面抗原檢測和成脂、成骨分化能力鑒定。取P5～8代BMSCs用于后續(xù)試驗。 1.2.2 SD大鼠心肌梗死模

7、型制作10％水合氯醛全麻SD大鼠，氣管插管，連接動物呼吸機，調整潮氣量，連接BL-420生物機能實驗系統(tǒng)記錄大鼠心電圖變化。備皮。在心尖波動最明顯處上一肋間開胸，暴露心臟，撕開心包。用7／0眼科帶線縫合針結扎左冠狀動脈前降支。術后肌肉注射青霉素G鈉20萬U／只，連續(xù)3天，預防手術感染。 1.2.3 BMSCs移植心肌梗死模型鼠SD大鼠心肌梗死模型制作后24小時經尾靜脈注射1×106個／mlP5～8代BMSCs細胞懸液給BMSCs

8、治療組大鼠，1ml／只。 1.2.4超聲心動圖檢測各組大鼠在處死前運用二維超聲機檢測大鼠心臟功能。左心長軸斷面測量LVDs、LVDd、IVSs、IVSd、LVPWs、LVPWd、EF等參數(shù)。心尖四腔心斷面測量E／A值。 1.2.4TGF-β1、TNF-α mRNA表達水平檢測取心梗模型鼠梗死區(qū)及梗死周圍約5-8mm區(qū)域內心臟組織，Trizol提取組織總RNA。紫外分光光度計測A260、A280及OD值。RT-PCR檢測Ⅰ

9、、Ⅲ膠原、TNF-α、TGF-β 1mRNA表達水平。 1.2.5 Ⅰ、Ⅲ型膠原表達情況檢測石蠟包埋各組大鼠心臟組織標本。切片，HE染色。免疫組化采用SABC法，一抗稀釋度為1：800，4℃孵育過夜，DAB顯色。PBS代替一抗做陰性對照。 1.2.6統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行t檢驗和單因素方差分析，顯著性檢驗水準為α=0.05。 2 結果： 2.1大鼠BMSCs分離、培養(yǎng)、鑒定以差速貼

10、壁法分離培養(yǎng)的原代BMSCs，其貼壁細胞多呈梭形或成纖維狀。3代以上的BMSCs趨于純化，多數(shù)呈均一典型的“紡錘狀”成纖維樣細胞形態(tài)，細胞間排列呈旋渦狀。經FCM檢測，BMSCs表達CD29和CD44分子，而不表達CD11b和CD45分子。體外能夠誘導BMSCs向成骨細胞和脂肪細胞分化，表明具有多項分化潛能。 2.2 SD大鼠心肌梗死模型結扎SD大鼠左冠狀動脈前降支后，左室前壁立刻由鮮紅色變?yōu)榘导t色，搏動減弱。手術后24小時心電圖檢測出

11、現(xiàn)病理性Q波，提示大鼠心肌梗死模型制作成功。 2.3經尾靜脈移植BMSCs經尾靜脈移植BMSCs前靜脈回抽見有紅色血液，注射BMSCs過程順利，沒有阻擋感。注射結束后，局部組織未見腫脹及出血。 2.4大鼠心功能模型對照組大鼠左室舒張末期及收縮末期內徑逐漸擴大，左室進行性擴張，左室收縮功能下降明顯，射學分數(shù)與正常對照組相比差異明顯。BMSCs治療組大鼠左室舒張末期及收縮末期內徑雖逐步擴大，但與模型對照組相比心室擴張受到明顯

12、遏制，射血分數(shù)與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，左室收縮功能與模型對照組相比明顯改善。 2.5大鼠心肌TGF-β1、TNF-α mRNA表達水平BMSCs治療組大鼠TGF-β、TNF-α DNA電泳條帶灰度變化呈現(xiàn)出與模型對照組相同的規(guī)律，但BMSCs治療組電泳條帶灰度明顯減弱。TGF-β1、TNF-α mRNA表達水平低于模型對照組。 2.5大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原表達情況BMSCs治療組大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原沉積呈網絡狀，

13、與模型對照組相比纖維束纖細，纖維網絡稀疏，未見粗大纖維束連接成片。 3 結論： 3.1 體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs具有良好的增殖能力，表達干細胞表面標志物，且具有成脂、成骨多向分化潛能。 3.2同種異體BMSCs尾靜脈移植治療心肌梗死模型大鼠后可改善大鼠左心室心功能。 3.3同種異體BMSCs尾靜脈移植治療心肌梗死模型大鼠后可降低模型鼠心肌TGF-β1、TNF-α mRNA表達水平。 3.4同種異體