海洋環(huán)境主要人致病性病原體寡核苷酸檢測(cè)芯片的研制與應(yīng)用.pdf

1、海洋環(huán)境中所有已知的人類致病性病毒均可能通過(guò)糞——口途徑危害公眾健康，許多人致病性病毒能夠隨著糞便被排放環(huán)境中，進(jìn)而通過(guò)污水、地表徑流進(jìn)入海水環(huán)境中。世界上大部分人口居住在沿海地區(qū)，因此，廢水經(jīng)常被直接或間接的排入到近海，已經(jīng)影響到人類和生態(tài)系統(tǒng)健康。若干研究表明，甲型肝炎病毒（HAV）、諾瓦克樣病毒（NOV）、輪狀病毒（ROV）、星狀病毒（ASV）、以及腸道腺病毒（ADV）能夠在海洋環(huán)境中被檢測(cè)到。海洋環(huán)境中只要存在一個(gè)活的人致病性病

2、毒粒子，就存在再次感染人的機(jī)會(huì)。三十年事故發(fā)生的數(shù)據(jù)表明調(diào)查海洋環(huán)境中的人類病毒是十分必要的。海洋環(huán)境受到人類致病性病毒污染將不斷地成為一個(gè)重要的公眾健康問(wèn)題，了解和控制近岸環(huán)境中病毒污染的關(guān)鍵是應(yīng)用有效的方法來(lái)檢測(cè)和分析這些病毒。 為解決這一難題，多年來(lái)該領(lǐng)域的工作者在細(xì)菌學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)以及微生物學(xué)等領(lǐng)域做了大量的工作，建立了包括細(xì)胞培養(yǎng)、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)檢測(cè)方法在內(nèi)的許多新的病原體診斷技術(shù)。以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的

3、各種分子生物學(xué)診斷技術(shù)，成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)最有價(jià)值的研究手段和病毒學(xué)診斷的標(biāo)準(zhǔn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種病原體的同步檢測(cè)，為該類病原微生物的檢測(cè)帶來(lái)了突破性進(jìn)展。但PCR的方法雖然敏感性高，可同時(shí)檢測(cè)多種病原體的數(shù)量有限。而生物芯片技術(shù)的發(fā)展則提供了一種解決這一問(wèn)題的途徑，本研究擬構(gòu)建平行檢測(cè)海洋環(huán)境中常見(jiàn)的人致病性腸道病原體的寡核苷酸芯片，并且應(yīng)用于對(duì)取自全國(guó)各海區(qū)的貝樣的檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)芯片檢測(cè)的特異性和敏

4、感性。 研究目的： 以醛基化玻片為基片，構(gòu)建一種用于檢測(cè)HAV、ROV、NOV、ASV、ADV五種常見(jiàn)病原體的寡核苷酸芯片，用于海洋人致病性腸道病毒病原體的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)，對(duì)海洋環(huán)境和相應(yīng)產(chǎn)品的安全性進(jìn)行評(píng)估。 研究?jī)?nèi)容及方法： 1．根據(jù)病原體的特異性基因序列設(shè)計(jì)五種病原體70mer左右的寡核苷酸長(zhǎng)探針。 2．優(yōu)化70mer探針的芯片的點(diǎn)樣濃度、點(diǎn)樣后的固定方法，優(yōu)化適合長(zhǎng)探針的各種雜交條件。

5、 3．在優(yōu)化的條件基礎(chǔ)上，選擇特異性好的探針構(gòu)建不同種屬多種病原體的寡核苷酸芯片，設(shè)計(jì)五種病原體的長(zhǎng)探針寡核苷酸芯片。 4．芯片的重復(fù)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。 5．采用該寡核苷酸芯片對(duì)取自全國(guó)各海區(qū)的海水樣本進(jìn)行檢測(cè)并與和PCR檢測(cè)方法進(jìn)行比較，進(jìn)行特異性和靈敏性評(píng)價(jià)。 結(jié)果： 1．選擇病原體具有特異性保守序列設(shè)計(jì)出70mer左右的長(zhǎng)片斷寡核苷酸探針，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)毒株檢測(cè)證明該檢測(cè)芯片的探針具有很好的特異性。

6、 2．通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化制備病原體長(zhǎng)探針寡核苷酸芯片的制備方法，探針點(diǎn)樣濃度和雜交液及雜交溫度，實(shí)驗(yàn)證明點(diǎn)樣濃度在10μmol/L時(shí)就可獲得滿意的熒光強(qiáng)度。探針點(diǎn)樣后37℃水合，在3600mJ條件下進(jìn)行紫外交聯(lián)固定效果最好。優(yōu)化出的雜交液成分：50％甲酰胺、5×SSC、0．5％SDS，雜交時(shí)間為9h，雜交溫度為65℃。這些條件為下一步制備多種病原體的寡核苷酸芯片檢測(cè)系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。 3．以優(yōu)化的條件制備的寡核苷酸芯片對(duì)海水標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)

7、果表明，制備的寡核苷酸芯片檢測(cè)體系與PCR法的檢測(cè)結(jié)果相比，兩種檢測(cè)方法沒(méi)有顯著性差異（P>0．05），且一致性較好（Kappa值均大于0．75），可以獲得理想的檢測(cè)效果。 結(jié)論： 1．70mer寡核苷酸探針具有更好的特異性，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用70mer的探針明顯的提高芯片的雜交結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。 2．本研究構(gòu)建的五種病原體平行檢測(cè)寡核苷酸芯片技術(shù)體系具有檢測(cè)相對(duì)快速、方便、準(zhǔn)確，可以高通量的檢測(cè)海水樣本及海洋