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1、該研究首先確立了長(zhǎng)鏈寡核苷酸基因芯片實(shí)驗(yàn)的基本條件,通過(guò)采用幾種不同的基質(zhì)材料進(jìn)行點(diǎn)樣雜交,以獲得最適合長(zhǎng)鏈寡核苷酸點(diǎn)樣的片基材料以及最適的點(diǎn)樣濃度和特異性.進(jìn)而確定了用于寡核苷酸芯片雜交檢測(cè)所需要的最佳探針片段長(zhǎng)度.然后根據(jù)NCBI網(wǎng)站GENEBANK數(shù)據(jù)庫(kù)中SARS-CoV的序列信息,采用生物信息學(xué)方法設(shè)計(jì)了長(zhǎng)度為60mer的寡核苷酸作為探針,并對(duì)其進(jìn)行BLAST比對(duì),采用了嚴(yán)格的遴選標(biāo)準(zhǔn),從中選出特異性高的30條作為探針,點(diǎn)樣制備
2、SARS冠狀病毒60mer寡核苷酸檢測(cè)基因芯片,采用vero E6細(xì)胞培養(yǎng)的SARS-CoV作為陽(yáng)性對(duì)照樣品,采用HepG2細(xì)胞總RNA作為陰性對(duì)照樣品進(jìn)行對(duì)比研究.通過(guò)采用限制性熒光標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行全基因組擴(kuò)增標(biāo)記,標(biāo)記產(chǎn)物純化后與芯片進(jìn)行雜交,采用激光共聚焦掃描儀進(jìn)行掃描,Array-ProAnalyzer軟件采集圖像并進(jìn)行圖像分析,分別對(duì)陽(yáng)性、陰性對(duì)照的樣品雜交結(jié)果進(jìn)行分析,進(jìn)而對(duì)探針進(jìn)行了篩選和最終的確定.為解決臨床樣品病毒含量低,
3、以及可能存在的樣品污染等問(wèn)題,該研究對(duì)限制性熒光標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn).通過(guò)在擴(kuò)增體系中加入熒光標(biāo)記的dNTP對(duì)樣品同時(shí)進(jìn)行兩種熒光標(biāo)記,提高了單位分子標(biāo)記片段的熒光強(qiáng)度值,并增加了檢測(cè)的靈敏度.同時(shí),在樣品標(biāo)記過(guò)程中還引入了防污染措施,可防止陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物污染可能造成的假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn).通過(guò)上述過(guò)程制備Oligo芯片用于中試規(guī)模的臨床檢測(cè),由廣東省疾病預(yù)防控制中心采集601例臨床樣品(200例臨床確診患者咽漱液樣品,401例臨床排除患者以及
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