山羊BLG調控序列及CMV增強子指導人胰島素原基因在細胞和小鼠中表達.pdf

1、糖尿病是一種以胰島素缺乏及高血糖為主要特征的自身免疫性疾病。目前治療除注射外源性胰島素外，尚無其他切實有效的方法。近年來，隨著轉基因技術的發(fā)展，利用轉基因技術生產人胰島素的方法是目前研究的熱點。 本實驗室已經用人胰島素原基因組DNA與山羊乳蛋白調控序列、增強子序列以及新霉素抗性基因構建了人胰島素原基因乳腺特異性表達載體BIC13。本課題利用該表達載體在細胞和動物水平上的表達特性，來驗證其在乳腺生物反應器上生產的可行性。

2、本試驗采用電穿孔方法將人胰島素原基因乳腺特異性表達載體片段導入奶山羊乳腺上皮細胞，經含400μg/ml G418的篩選培養(yǎng)液篩選培養(yǎng)兩周，得到有抗性的細胞株。挑取單克隆株進行擴大培養(yǎng)后。提取其細胞基因組，經PCR檢測后，對陽．性細胞株用催乳素誘導表達，48小時后提取細胞誘導液，用ELISA法檢測誘導液中的胰島素原。結果獲得6株表達的陽性細胞株。 本試驗采用顯微注射的方法將人胰島素原乳腺特異性表達載體片段注射入小鼠受精卵的雄原核，

3、對出生的小鼠經PCR整合檢測后，對篩選到的陽性小鼠用ELISA法檢測其乳汁及血液中胰島素原。本次試驗共注射632枚受精卵，存活471枚卵。產仔43只。通過PCR整合檢測，獲得一只轉基因陽性小鼠(編號＃6)，對其乳汁和血液的ELISA檢測表明該構件可在小鼠乳腺中表達并具有乳腺特異性。 因此，本實驗室構建的人胰島素原基因乳腺特異性表達載體不僅能有效的指導人胰島素原在山羊乳腺上皮細胞和小鼠乳腺中的表達，而且具有乳腺組織特異性?？梢杂糜?/p>