BMP9需通過調控Notch信號通路誘導間充質干細胞成骨分化及其作用機制研究.pdf

1、骨是成年人體中少數幾個仍保持再生潛能的器官之一，是唯一一個生命中能保持不斷重塑的器官。骨有兩種形成方式即膜內成骨和軟骨內成骨。骨再生與軟骨內成骨相似，主要始于間充質干細胞的趨化和增殖。有效的骨再生在臨床上許多骨或肌肉骨骼系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著非常重要的作用，如部分骨缺損、骨折不愈合，骨質疏松性骨折，失敗的脊椎融合術等。因此，探究闡明骨形成的分子機制對于了解骨疾病的發(fā)病機理至關重要。
　　在胚胎成骨以及成人骨修復和骨轉換中涉及到一類被廣泛

2、應用的細胞—間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)，傳統(tǒng)認為MSCs主要存在于骨髓，但是后期研究發(fā)現MSCs也可以存在其他組織器官。MSCs具有多向分化潛能，能分別向成骨、成脂、成軟骨、成纖維等細胞系分化。有許多研究顯示有許多不同的信號通路在調控干細胞自我更新及世系提交等方面發(fā)揮著重要的作用，但是在骨再生研究中調控間充質干細胞向成骨方向分化的機制是需要關注且探討的關鍵性問題。
　　骨形態(tài)發(fā)生蛋白（B

3、one Morphorgenetic Proteins，BMPs）對于發(fā)育過程中的細胞增殖和分化都發(fā)揮著重要的作用，可以調控間充質干細胞向骨、軟骨、脂肪和肌腱等方向分化，是研究比較早，也是最具有潛力的一類誘導MSCs成骨分化的細胞因子。BMPs屬于TGF-β超家族成員，目前已知有20余種BMPs。本實驗室前期對BMP2-BMP15共14種BMPs進行了系統(tǒng)分析，發(fā)現BMP9是誘導間充質干細胞在體內和體外成骨分化能力最強的BMPs成員。<

4、br>　　BMP9（也稱為生長分化因子2，GDF-2）最初是從生長發(fā)育的小鼠肝臟中分離得到的，它的作用包括:誘導和維持前腦膽堿能神經元的表型，抑制肝臟葡萄糖產生，誘導脂代謝關鍵酶表達及刺激小鼠鐵調素1的表達。BMP9誘導成骨的活性具有潛在的臨床應用價值，也越來越受到關注，但是BMP9在誘導干細胞成骨過程中的調節(jié)機制卻不甚明了。許多其他生長因子可能與BMP9誘導成骨存在協同或拮抗作用，本實驗室也已經進一步證實了BMP9調節(jié)著一系列特異的下

5、游靶通路，這些通路的因子都在BMP9誘導的間充質干細胞成骨分化過程中發(fā)揮著重要作用。
　　本實驗研究的目的是:探究(1) Notch信號通路是否與BMP9在誘導間充質干細胞成骨分化中存在著必然的聯系;(2) Notch信號通路在BMP9誘導間充質干細胞成骨分化中發(fā)揮著關鍵且不可缺的作用;(3) BMP9調控Notch信號通路誘導間充質干細胞成骨分化的可能機制。
　　在本研究的第一部分:首先，使用Notch信號傳導通路中的關鍵

6、酶γ-分泌酶的抑制劑Compound E抑制了γ-分泌酶的活性，通過檢測早期成骨指標堿性磷酸酶(ALP)活性，研究其對BMP9誘導間充質干細胞成骨分化作用的影響，結果表明:抑制γ-分泌酶的活性可以降低BMP9誘導iMEFs細胞的早期成骨作用。隨后，通過茜素紅S染色分析成骨晚期指標鈣鹽沉積的情況，結果顯示抑制γ-分泌酶的活性可以降低BMP9誘導的iMEFs細胞的晚期成骨作用。此部分初步證實，Notch信號通路在BMP9誘導間充質干細胞成骨

7、分化中發(fā)揮著重要的作用，為后續(xù)研究奠定基礎。
　　接下來，提取iMEFs總RNA，通過RT-PCR檢測Notch受體和配體的內源性表達情況，結果表明Notch1表達最多，而Notch4，DLL3及DLL4則看不到表達。因此，我們想看看表達最多的Notch1對BMP9誘導iMEFs細胞成骨分化的影響，提取顯性負性Notch1(dnNotch1)腺病毒感染過的iMEFs的總RNA，進行RT-PCR證實dnNotch1的競爭性抑制作用，

8、為接下來的體內和體外實驗保證抑制Notch1活性奠定基礎。體外實驗，通過ALP定性和定量實驗，免疫細胞化學檢測OPN和OCN表達以及茜素紅S染色實驗結果表明，dnNotch1可以抑制BMP9誘導間充質干細胞早期成骨指標ALP的活性，抑制晚期成骨指標OPN和OCN的表達以及抑制鈣鹽沉積，并且其抑制作用存在劑量依賴性。體內實驗，將腺病毒dnNotch1和BMP9共同感染iMEFs，在裸鼠皮下進行注射，檢測dnNotch1競爭性抑制Notch

9、1后，對BMP9誘導的間充質干細胞的體內成骨作用的影響，結果表明:(1)細胞接種4周后，各組都形成了堅硬的包塊，表明各組均有骨組織形成。(2)Micro-CT掃描和影像重建結果顯示抑制Notch1作用可降低形成的骨包塊的體積。(3)石蠟包埋、切片進行HE染色，結果顯示dnNotch1能夠抑制骨小梁數量及形成質量。(4) Alcian Blue染色結果顯示dnNotch1能導致不成熟的軟骨基質形成。(5) Masson's Trichro

10、me染色結果顯示dnNotch1導致藍綠色的骨基質明顯減少，骨組織成熟度降低?？傊?，抑制Notch1的活性，能夠降低BMP9-誘導的間充質干細胞體內成骨分化的數量以及成熟質量，這與之前的體外實驗結果亦相吻合。
　　通過前面兩個方面的研究，可知道Notch與BMP9在誘導間充質干細胞成骨分化方面存在著密切的聯系。然后，又引入使用兩個配體Jagged1和DLL1過表達腺病毒，通過提取腺病毒Jagged1或DLL1感染過的iMEFs細胞

11、的總RNA，進行RT-PCR驗證Jagged1及DLL1過表達的效果，為后續(xù)實驗打基礎。在體外實驗中，用Jagged1或DLL1與BMP9聯合感染iMEFs后，通過ALP定性和定量實驗檢測早期成骨指標ALP活性，免疫細胞化學檢測成骨晚期指標OPN和OCN表達以及茜素紅S染色檢測晚期成骨指標鈣鹽沉積，結果顯示DLL1能夠在體外增強BMP9誘導iMEFs成骨分化的作用，Jagged1能在體外增強BMP9誘導的ALP活性，鈣鹽沉積及OPN的表

12、達。體內實驗，將Jagged1或DLL1和BMP9共感染iMEFs細胞，對裸鼠進行皮下注射，4周后觀察并獲取皮下包塊，Micro-CT掃描和影像重建，石蠟包埋，切片，進行組織化學染色（HE染色，Alcian Blue染色和Masson's Trichrome染色），結果顯示， DLL1能增加BMP9誘導的iMEFs成骨分化活躍程度，與體內實驗結果相一致，而Jagged1則能增加軟骨形成，降低骨成熟度?？傊?DLL1過表達能夠增強BMP

13、9誘導的間充質干細胞成骨分化，而Jagged1則降低骨成熟度。
　　進一步，想最終確認Notch信號通路與BMP9的密切聯系，引入使用兩個特殊的小鼠成纖維干細胞株DKO-PS1:PS1（γ-分泌酶關鍵成分）及PS2雙敲除后，外源性植入PS1進行補救，相當于正常細胞株;DKO-EV: PS1及PS2雙敲除后，外源性植入空載體，做對照，想檢測當PS1敲除后，Notch信號傳導受阻礙對BMP9誘導的間充質干細胞成骨分化的影響。首先，采用

14、Western Blot檢測PS1及nacastin的表達情況，證實PS1確實補救成功。緊接著，通過體外實驗檢測，BMP9誘導的間充質干細胞成骨分化的早期指標ALP的活性及晚期指標OPN和OCN的表達情況及晚期指標鈣鹽沉積情況，結果顯示PS1敲除相比PS1補救的iMEFs，BMP9誘導成骨分化的作用明顯降低。體內實驗結果顯示，PS1敲除后BMP9誘導的骨形成包塊體積明顯減小，骨小梁數量及形成質量明顯降低，骨包塊的成熟程度及骨形成過程的活

15、躍度度亦明顯降低?？傊?，此部分結果表明PS1作為Notch關鍵酶γ-分泌酶的關鍵成分在BMP9誘導的iMEFs成骨分化中發(fā)揮著關鍵而不可缺的作用，進一步說明Notch信號通路在BMP9誘導成骨分化中的關鍵作用。
　　通過第一部分的結果，初步了解到:(1)抑制γ-分泌酶的活性能降低BMP9誘導的iMEFs在體內及體外的成骨作用;(2) dnNotch1競爭與配體結合從而抑制Notch1活性亦能在體內及體外降低BMP9誘導iMEFs的

16、成骨作用;(3)過表達配體DLL1能增加體內及體外BMP9誘導的成骨作用，Jagged1能增加體外BMP9誘導成骨作用，而在體內增加軟骨形成，降低骨成熟度;(4)敲除γ-分泌酶關鍵成分PS1干擾Notch信號傳導能明顯降低BMP9誘導的iMEFs在體內及體外的成骨作用?？傊?，可以認識到Notch信號通路在BMP9誘導的成骨分化中發(fā)揮著重要不可缺的作用，Notch信號通路是BMP9發(fā)揮作用的重要的下游靶通路。因此，在第二部分將初步探討-B

17、MP9調控Notch信號通路的機制:(1) dnNotch1競爭與配體結合抑制Notch1活性，Jagged1或DLL1過表達，敲除γ-分泌酶關鍵成分PS1，對BMP9誘導iMEFs成骨分化早期細胞增殖及細胞周期的影響;(2) BMP9促進iMEFs成骨分化過程Notch胞內段NICD及Notch1在細胞內表達情況;(3)iMEFs細胞中BMP9誘導iMEFs成骨分化過程中Notch家族受體及配體基因表達情況及PS1敲除后BMP9作用下

18、Runx2、OPN、OCN、Hey1、Id1和CTGF表達變化。
　　首先，流式細胞術檢測，作用24h后，dnNotch1能明顯降低BMP9促進iMEFs增殖的作用，即G2期及G2+S期明顯降低;Jagged1或DLL1則能明顯增加BMP9的作用，即G2期及G2+S期明顯增高;DKO-PS1相比DKO-EV的G2期及S期+G2期同樣明顯升高。這部分表明，BMP9在誘導間充質干細胞成骨分化早期具有促進細胞增殖的作用而Notch信號通

19、路在BMP9促進細胞增殖中發(fā)揮著必不可少的作用。
　　其次，免疫細胞熒光化學檢測，作用24h后，BMP9能明顯增加iMEFs細胞中Notch胞內段NICD的表達，并且主要定位于細胞核內，同樣BMP9也能增加細胞中Notch1的表達。
　　然后，通過RT-PCR檢測BMP9作用下，Notch受體和配體mRNA在iMEFs細胞中的表達情況，從結果看，不同的Notch成員呈現不同的表達趨勢。從第1-3天，不同的Notch成員表達變

20、化完全不同。在第1天BMP9明顯促進Notch1、Notch2及DLL4的表達，而對Jagged2及DLL1有輕度抑制表達作用，BMP9促進表達的Notch成員多于抑制表達的成員。接著，將PS1敲除后，BMP9作用下，第3天及第5天Runx2、OCN、OPN和Id1明顯降低，Id1在PS1補救后第5天比第3天表達降低;第2天， BMP9作用下DKO-PS1的Hey1及CTGF都明顯高于DKO-EV。
　　通過第二部分結果，得知:(

21、1) BMP9在誘導間充質干細胞早期能夠促進細胞的增殖，在抑制Notch1活性及敲除PS1后，BMP9促進細胞增殖的作用也隨之下降，Jagged1及DLL1則能增加這種促進作用。這可能與Notch參與了BMP9早期促進間充質干細胞增殖的作用相關。
　　(2) BMP9能夠增加Notch胞內段NICD的表達，并且促進其轉移到核內，同時也能增加Notch1的表達，可能由于BMP9促進Notch1等Notch成員的表達，從而激活信號傳導

22、，NICD表達增多并解離，繼而進入細胞核內促進下游靶基因的轉錄表達。(3) BMP9作用下，Notch家族成員表達均發(fā)生不同變化，第1天BMP9促進表達的Notch成員多于抑制表達的成員，尤其Notch1表達明顯增高。PS1缺失情況下，Ru似2、OPN、OCN、Hey1、Id1和CTGF表達均降低，說明BMP9可以調控Notch表達發(fā)生變化，而BMP9調控靶基因作用又需要有Notch參與。
　　綜上所述，抑制Notch信號通路能抑

23、制BMP9誘導的間充質干細胞成骨分化中;抑制Notch1活性能抑制BMP9誘導的間充質于細胞增殖和成骨分化中;DLL1增加BMP9誘導的間充質干細胞增殖和成骨分化，Jagged1能增加BMP9誘導的間充質干細胞增殖和體外成骨分化;BMP9作用下，Notch受體和配體均發(fā)生不同的表達變化，可能是BMP9通過早期作用于Notch1或其它成員導致其表達發(fā)生變化，從而激活Notch如Notch1-DLL1信號傳導通路，而增加Notch1胞內段N