BMP9需通過(guò)調(diào)控Notch信號(hào)通路誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及其作用機(jī)制研究.pdf

1、骨是成年人體中少數(shù)幾個(gè)仍保持再生潛能的器官之一，是唯一一個(gè)生命中能保持不斷重塑的器官。骨有兩種形成方式即膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨。骨再生與軟骨內(nèi)成骨相似，主要始于間充質(zhì)干細(xì)胞的趨化和增殖。有效的骨再生在臨床上許多骨或肌肉骨骼系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著非常重要的作用，如部分骨缺損、骨折不愈合，骨質(zhì)疏松性骨折，失敗的脊椎融合術(shù)等。因此，探究闡明骨形成的分子機(jī)制對(duì)于了解骨疾病的發(fā)病機(jī)理至關(guān)重要。
　　在胚胎成骨以及成人骨修復(fù)和骨轉(zhuǎn)換中涉及到一類被廣泛

2、應(yīng)用的細(xì)胞—間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)，傳統(tǒng)認(rèn)為MSCs主要存在于骨髓，但是后期研究發(fā)現(xiàn)MSCs也可以存在其他組織器官。MSCs具有多向分化潛能，能分別向成骨、成脂、成軟骨、成纖維等細(xì)胞系分化。有許多研究顯示有許多不同的信號(hào)通路在調(diào)控干細(xì)胞自我更新及世系提交等方面發(fā)揮著重要的作用，但是在骨再生研究中調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化的機(jī)制是需要關(guān)注且探討的關(guān)鍵性問(wèn)題。
　　骨形態(tài)發(fā)生蛋白（B

3、one Morphorgenetic Proteins，BMPs）對(duì)于發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞增殖和分化都發(fā)揮著重要的作用，可以調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向骨、軟骨、脂肪和肌腱等方向分化，是研究比較早，也是最具有潛力的一類誘導(dǎo)MSCs成骨分化的細(xì)胞因子。BMPs屬于TGF-β超家族成員，目前已知有20余種BMPs。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)BMP2-BMP15共14種BMPs進(jìn)行了系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)BMP9是誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)和體外成骨分化能力最強(qiáng)的BMPs成員。<

4、br>　　BMP9（也稱為生長(zhǎng)分化因子2，GDF-2）最初是從生長(zhǎng)發(fā)育的小鼠肝臟中分離得到的，它的作用包括:誘導(dǎo)和維持前腦膽堿能神經(jīng)元的表型，抑制肝臟葡萄糖產(chǎn)生，誘導(dǎo)脂代謝關(guān)鍵酶表達(dá)及刺激小鼠鐵調(diào)素1的表達(dá)。BMP9誘導(dǎo)成骨的活性具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，也越來(lái)越受到關(guān)注，但是BMP9在誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨過(guò)程中的調(diào)節(jié)機(jī)制卻不甚明了。許多其他生長(zhǎng)因子可能與BMP9誘導(dǎo)成骨存在協(xié)同或拮抗作用，本實(shí)驗(yàn)室也已經(jīng)進(jìn)一步證實(shí)了BMP9調(diào)節(jié)著一系列特異的下

5、游靶通路，這些通路的因子都在BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。
　　本實(shí)驗(yàn)研究的目的是:探究(1) Notch信號(hào)通路是否與BMP9在誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中存在著必然的聯(lián)系;(2) Notch信號(hào)通路在BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中發(fā)揮著關(guān)鍵且不可缺的作用;(3) BMP9調(diào)控Notch信號(hào)通路誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的可能機(jī)制。
　　在本研究的第一部分:首先，使用Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵

6、酶γ-分泌酶的抑制劑Compound E抑制了γ-分泌酶的活性，通過(guò)檢測(cè)早期成骨指標(biāo)堿性磷酸酶(ALP)活性，研究其對(duì)BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化作用的影響，結(jié)果表明:抑制γ-分泌酶的活性可以降低BMP9誘導(dǎo)iMEFs細(xì)胞的早期成骨作用。隨后，通過(guò)茜素紅S染色分析成骨晚期指標(biāo)鈣鹽沉積的情況，結(jié)果顯示抑制γ-分泌酶的活性可以降低BMP9誘導(dǎo)的iMEFs細(xì)胞的晚期成骨作用。此部分初步證實(shí)，Notch信號(hào)通路在BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨

7、分化中發(fā)揮著重要的作用，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
　　接下來(lái)，提取iMEFs總RNA，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)Notch受體和配體的內(nèi)源性表達(dá)情況，結(jié)果表明Notch1表達(dá)最多，而Notch4，DLL3及DLL4則看不到表達(dá)。因此，我們想看看表達(dá)最多的Notch1對(duì)BMP9誘導(dǎo)iMEFs細(xì)胞成骨分化的影響，提取顯性負(fù)性Notch1(dnNotch1)腺病毒感染過(guò)的iMEFs的總RNA，進(jìn)行RT-PCR證實(shí)dnNotch1的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，

8、為接下來(lái)的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)保證抑制Notch1活性奠定基礎(chǔ)。體外實(shí)驗(yàn)，通過(guò)ALP定性和定量實(shí)驗(yàn)，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)OPN和OCN表達(dá)以及茜素紅S染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，dnNotch1可以抑制BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞早期成骨指標(biāo)ALP的活性，抑制晚期成骨指標(biāo)OPN和OCN的表達(dá)以及抑制鈣鹽沉積，并且其抑制作用存在劑量依賴性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，將腺病毒dnNotch1和BMP9共同感染iMEFs，在裸鼠皮下進(jìn)行注射，檢測(cè)dnNotch1競(jìng)爭(zhēng)性抑制Notch

9、1后，對(duì)BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)成骨作用的影響，結(jié)果表明:(1)細(xì)胞接種4周后，各組都形成了堅(jiān)硬的包塊，表明各組均有骨組織形成。(2)Micro-CT掃描和影像重建結(jié)果顯示抑制Notch1作用可降低形成的骨包塊的體積。(3)石蠟包埋、切片進(jìn)行HE染色，結(jié)果顯示dnNotch1能夠抑制骨小梁數(shù)量及形成質(zhì)量。(4) Alcian Blue染色結(jié)果顯示dnNotch1能導(dǎo)致不成熟的軟骨基質(zhì)形成。(5) Masson's Trichro

10、me染色結(jié)果顯示dnNotch1導(dǎo)致藍(lán)綠色的骨基質(zhì)明顯減少，骨組織成熟度降低?？傊?，抑制Notch1的活性，能夠降低BMP9-誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)成骨分化的數(shù)量以及成熟質(zhì)量，這與之前的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦相吻合。
　　通過(guò)前面兩個(gè)方面的研究，可知道Notch與BMP9在誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化方面存在著密切的聯(lián)系。然后，又引入使用兩個(gè)配體Jagged1和DLL1過(guò)表達(dá)腺病毒，通過(guò)提取腺病毒Jagged1或DLL1感染過(guò)的iMEFs細(xì)胞

11、的總RNA，進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證Jagged1及DLL1過(guò)表達(dá)的效果，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打基礎(chǔ)。在體外實(shí)驗(yàn)中，用Jagged1或DLL1與BMP9聯(lián)合感染iMEFs后，通過(guò)ALP定性和定量實(shí)驗(yàn)檢測(cè)早期成骨指標(biāo)ALP活性，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)成骨晚期指標(biāo)OPN和OCN表達(dá)以及茜素紅S染色檢測(cè)晚期成骨指標(biāo)鈣鹽沉積，結(jié)果顯示DLL1能夠在體外增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)iMEFs成骨分化的作用，Jagged1能在體外增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)的ALP活性，鈣鹽沉積及OPN的表

12、達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，將Jagged1或DLL1和BMP9共感染iMEFs細(xì)胞，對(duì)裸鼠進(jìn)行皮下注射，4周后觀察并獲取皮下包塊，Micro-CT掃描和影像重建，石蠟包埋，切片，進(jìn)行組織化學(xué)染色（HE染色，Alcian Blue染色和Masson's Trichrome染色），結(jié)果顯示， DLL1能增加BMP9誘導(dǎo)的iMEFs成骨分化活躍程度，與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，而Jagged1則能增加軟骨形成，降低骨成熟度。總之， DLL1過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)BMP

13、9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，而Jagged1則降低骨成熟度。
　　進(jìn)一步，想最終確認(rèn)Notch信號(hào)通路與BMP9的密切聯(lián)系，引入使用兩個(gè)特殊的小鼠成纖維干細(xì)胞株DKO-PS1:PS1（γ-分泌酶關(guān)鍵成分）及PS2雙敲除后，外源性植入PS1進(jìn)行補(bǔ)救，相當(dāng)于正常細(xì)胞株;DKO-EV: PS1及PS2雙敲除后，外源性植入空載體，做對(duì)照，想檢測(cè)當(dāng)PS1敲除后，Notch信號(hào)傳導(dǎo)受阻礙對(duì)BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響。首先，采用

14、Western Blot檢測(cè)PS1及nacastin的表達(dá)情況，證實(shí)PS1確實(shí)補(bǔ)救成功。緊接著，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的早期指標(biāo)ALP的活性及晚期指標(biāo)OPN和OCN的表達(dá)情況及晚期指標(biāo)鈣鹽沉積情況，結(jié)果顯示PS1敲除相比PS1補(bǔ)救的iMEFs，BMP9誘導(dǎo)成骨分化的作用明顯降低。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PS1敲除后BMP9誘導(dǎo)的骨形成包塊體積明顯減小，骨小梁數(shù)量及形成質(zhì)量明顯降低，骨包塊的成熟程度及骨形成過(guò)程的活

15、躍度度亦明顯降低。總之，此部分結(jié)果表明PS1作為Notch關(guān)鍵酶γ-分泌酶的關(guān)鍵成分在BMP9誘導(dǎo)的iMEFs成骨分化中發(fā)揮著關(guān)鍵而不可缺的作用，進(jìn)一步說(shuō)明Notch信號(hào)通路在BMP9誘導(dǎo)成骨分化中的關(guān)鍵作用。
　　通過(guò)第一部分的結(jié)果，初步了解到:(1)抑制γ-分泌酶的活性能降低BMP9誘導(dǎo)的iMEFs在體內(nèi)及體外的成骨作用;(2) dnNotch1競(jìng)爭(zhēng)與配體結(jié)合從而抑制Notch1活性亦能在體內(nèi)及體外降低BMP9誘導(dǎo)iMEFs的

16、成骨作用;(3)過(guò)表達(dá)配體DLL1能增加體內(nèi)及體外BMP9誘導(dǎo)的成骨作用，Jagged1能增加體外BMP9誘導(dǎo)成骨作用，而在體內(nèi)增加軟骨形成，降低骨成熟度;(4)敲除γ-分泌酶關(guān)鍵成分PS1干擾Notch信號(hào)傳導(dǎo)能明顯降低BMP9誘導(dǎo)的iMEFs在體內(nèi)及體外的成骨作用。總之，可以認(rèn)識(shí)到Notch信號(hào)通路在BMP9誘導(dǎo)的成骨分化中發(fā)揮著重要不可缺的作用，Notch信號(hào)通路是BMP9發(fā)揮作用的重要的下游靶通路。因此，在第二部分將初步探討-B

17、MP9調(diào)控Notch信號(hào)通路的機(jī)制:(1) dnNotch1競(jìng)爭(zhēng)與配體結(jié)合抑制Notch1活性，Jagged1或DLL1過(guò)表達(dá)，敲除γ-分泌酶關(guān)鍵成分PS1，對(duì)BMP9誘導(dǎo)iMEFs成骨分化早期細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響;(2) BMP9促進(jìn)iMEFs成骨分化過(guò)程N(yùn)otch胞內(nèi)段NICD及Notch1在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況;(3)iMEFs細(xì)胞中BMP9誘導(dǎo)iMEFs成骨分化過(guò)程中Notch家族受體及配體基因表達(dá)情況及PS1敲除后BMP9作用下

18、Runx2、OPN、OCN、Hey1、Id1和CTGF表達(dá)變化。
　　首先，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，作用24h后，dnNotch1能明顯降低BMP9促進(jìn)iMEFs增殖的作用，即G2期及G2+S期明顯降低;Jagged1或DLL1則能明顯增加BMP9的作用，即G2期及G2+S期明顯增高;DKO-PS1相比DKO-EV的G2期及S期+G2期同樣明顯升高。這部分表明，BMP9在誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化早期具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用而Notch信號(hào)通

19、路在BMP9促進(jìn)細(xì)胞增殖中發(fā)揮著必不可少的作用。
　　其次，免疫細(xì)胞熒光化學(xué)檢測(cè)，作用24h后，BMP9能明顯增加iMEFs細(xì)胞中Notch胞內(nèi)段NICD的表達(dá)，并且主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，同樣BMP9也能增加細(xì)胞中Notch1的表達(dá)。
　　然后，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)BMP9作用下，Notch受體和配體mRNA在iMEFs細(xì)胞中的表達(dá)情況，從結(jié)果看，不同的Notch成員呈現(xiàn)不同的表達(dá)趨勢(shì)。從第1-3天，不同的Notch成員表達(dá)變

20、化完全不同。在第1天BMP9明顯促進(jìn)Notch1、Notch2及DLL4的表達(dá)，而對(duì)Jagged2及DLL1有輕度抑制表達(dá)作用，BMP9促進(jìn)表達(dá)的Notch成員多于抑制表達(dá)的成員。接著，將PS1敲除后，BMP9作用下，第3天及第5天Runx2、OCN、OPN和Id1明顯降低，Id1在PS1補(bǔ)救后第5天比第3天表達(dá)降低;第2天， BMP9作用下DKO-PS1的Hey1及CTGF都明顯高于DKO-EV。
　　通過(guò)第二部分結(jié)果，得知:(

21、1) BMP9在誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞早期能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖，在抑制Notch1活性及敲除PS1后，BMP9促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用也隨之下降，Jagged1及DLL1則能增加這種促進(jìn)作用。這可能與Notch參與了BMP9早期促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的作用相關(guān)。
　　(2) BMP9能夠增加Notch胞內(nèi)段NICD的表達(dá)，并且促進(jìn)其轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，同時(shí)也能增加Notch1的表達(dá)，可能由于BMP9促進(jìn)Notch1等Notch成員的表達(dá)，從而激活信號(hào)傳導(dǎo)

22、，NICD表達(dá)增多并解離，繼而進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。(3) BMP9作用下，Notch家族成員表達(dá)均發(fā)生不同變化，第1天BMP9促進(jìn)表達(dá)的Notch成員多于抑制表達(dá)的成員，尤其Notch1表達(dá)明顯增高。PS1缺失情況下，Ru似2、OPN、OCN、Hey1、Id1和CTGF表達(dá)均降低，說(shuō)明BMP9可以調(diào)控Notch表達(dá)發(fā)生變化，而B(niǎo)MP9調(diào)控靶基因作用又需要有Notch參與。
　　綜上所述，抑制Notch信號(hào)通路能抑

23、制BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中;抑制Notch1活性能抑制BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)于細(xì)胞增殖和成骨分化中;DLL1增加BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化，Jagged1能增加BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和體外成骨分化;BMP9作用下，Notch受體和配體均發(fā)生不同的表達(dá)變化，可能是BMP9通過(guò)早期作用于Notch1或其它成員導(dǎo)致其表達(dá)發(fā)生變化，從而激活Notch如Notch1-DLL1信號(hào)傳導(dǎo)通路，而增加Notch1胞內(nèi)段N