FGF2調控BMP9誘導的間充質干細胞成骨分化的作用及機制研究.pdf

1、目的:分析FGF2對BMP9誘導的間充質干細胞(mesenchymal stemcells，MSCS)成骨分化的影響極其相關分子機制。
　　方法:首先用Western blot檢測外源性FGF2或外源性BMP9是否影響MSCs細胞中內源性BMP9或FGF2的蛋白表達;然后以不同滴度的Ad-RFP和AdR-FGF2腺病毒感染細胞，并制備BMP9條件培養(yǎng)基，待Ad-RFP和AdR-FGF2腺病毒作用24h后加入BMP9條件培養(yǎng)基，觀察

2、成骨分化早期標志物堿性磷酸酶(Alkaline phosphotase，ALP)的變化;用結晶紫染色分析FGF2和BMP9對間充質干細胞增殖情況的影響;然后用茜素紅S染色的方法觀察成骨晚期標志物鈣鹽沉積的變化;通過Western blot檢測成骨晚期標志物骨橋蛋白(Osteopotin，OPN)和骨鈣蛋白(Osteocalcin，OCN)的變化。
　　隨后，通過PCR技術檢測FGF2對BMP9誘導成骨分化相關靶基因ID1、ID2、

3、ID3及成骨關鍵轉錄因子Runx2的影響;Western blot檢測FGF2對BMP9誘導的Runx2蛋白表達的影響;熒光素酶報告基因實驗和Western blot檢測FGF2對BMP9活化的經(jīng)典Smad1/5/8信號途徑和非經(jīng)典MAPKs(p38和ERK1/2)的影響;最后PCR檢測FGF2對于BMP9成骨相關Ⅰ型受體ALK1和ALK2的影響。
　　最后，利用FGF2和BMP9重組腺病毒感染間充質干細胞C3H10T1/2，利用

4、裸鼠皮下異位成骨實驗FGF2對于BMP9觀察在裸鼠皮下異位成骨的情況，并用H&E、Alcian Blue、 Masson's Trichrome對骨組織切片進行染色，觀察骨組織成熟度情況。
　　結果:Western blot檢測顯示外源性FGF2在間充質干細胞株C3H10T1/2細胞中不會影響內源性BMP9蛋白的表達（反之亦然）;而BMP9誘導的ALP活性隨著FGF2腺病毒感染滴度的不斷增高而逐漸下降;結晶紫染色結果顯示FGF2和

5、BMP9對間充質干細胞的增殖都有一定促進作用，兩者同時處理細胞時促進作用更明顯;在另一種間充質干細胞小鼠胚胎成纖維細胞（Mouse embryonic fibroblasts，MEFs）中，F(xiàn)GF2同樣可抑制其BMP9誘導的ALP活性，同時抑制了晚期成骨分化標志物鈣鹽沉積，以及OPN和OCN的表達。
　　PCR結果顯示FGF2抑制了BMP9相關靶基因ID1、ID2、ID3及成骨關鍵轉錄因子Runx2的基因表達，Western bl

6、ot檢測發(fā)現(xiàn)FGF2也同時抑制了關鍵的成骨轉錄因子Runx2的蛋白表達;FGF2和BMP9本身均可以激活MAPKs中的p38和ERK1/2信號通路，但是FGF2對于BMP9誘導的p38和ERK1/2的活化并無明顯影響;值得注意的是，F(xiàn)GF2可以抑制BMP9激活的經(jīng)典Smad1/5/8信號途徑，表現(xiàn)為BMP9誘導的SBE熒光素酶活性下降、及Smad1/5/8磷酸化水平下降;PCR結果顯示FGF2抑制了BMP9成骨相關相關Ⅰ型受體ALK1和