犬乳腺腫瘤細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定.pdf

1、乳腺腫瘤是犬貓最常發(fā)的腫瘤性疾病之一,犬乳腺腫瘤與人類的乳腺腫瘤在組織病理學和生物學上有相似的病理特征。如不考慮壽命等因素,犬乳腺腫瘤和人類乳腺腫瘤在腫瘤的發(fā)生年齡上也十分相似。由于犬作為人們喜愛的寵物,與人們生活在一起,與人們有著相似的生活環(huán)境和飲食習慣,接觸的致癌物質相似。因此,犬乳腺腫瘤可以作為研究人類乳腺腫瘤的理想動物模型。腫瘤細胞培養(yǎng)技術是研究細胞癌變的機理機制、腫瘤的分子生物學特征和抗癌藥物篩選的重要基礎技術。因此,本實驗在

2、此基礎上進行了以下工作:
　　1.犬乳腺腫瘤組織的采集、病理學診斷與分類
　　參照WHO新發(fā)布的犬乳腺癌分類分級方法,通過切片的HE染色方法對臨床收集的52例犬乳腺腫瘤組織進行病理學診斷。結果顯示在52例犬乳腺腫瘤中,良性乳腺腫瘤有20例,占總病例的38.5％,惡性乳腺腫瘤有32例,占總數(shù)的61.5%,本試驗為犬乳腺腫瘤組織的消化、細胞的分離與培養(yǎng)、細胞的傳代和鑒定奠定了基礎。
　　2.犬乳腺腫瘤組織中ZNF703定量

3、測定試驗
　　通過real-time PCR技術對8例正常犬乳腺組織、20例犬良性乳腺腫瘤組織、32例犬惡性乳腺腫組織mRNA中ZNF703(鋅指蛋白)的表達量進行檢測。結果顯示:不同犬乳腺腫瘤組織中ZNF703基因的平均表達量差異性很大。其中在8例正常乳腺組織樣本中的表達量為3.07-19.06;在20例良性犬乳腺腫瘤組織樣本中的表達量為10.85-43.16;在32例惡性犬乳腺腫瘤組織樣本中的表達量為9.43-253.39。正

4、常乳腺組織與良性乳腺腫瘤組織和惡性乳腺腫瘤組織ZNF703表達量均差異極顯著(p<0.01),良性乳腺腫瘤組織與惡性乳腺腫瘤組織ZNF703表達量差異也極顯著(p<0.01)。本試驗結果為犬乳腺腫瘤組織的分子生物學診斷和分類提供新的參考方法。
　　3.犬乳腺腫瘤細胞的分離、培養(yǎng)和篩選試驗
　　通過犬乳腺腫瘤細胞的分離、培養(yǎng)和篩選試驗,篩選和培養(yǎng)出11株犬乳腺上皮腫瘤細胞株,其傳代次數(shù)在10次以上,其中一株傳代次數(shù)超過38代(

5、CB-23),該試驗為后續(xù)試驗奠定了初步基礎。
　　4.犬乳腺腫瘤CB-23細胞株的鑒定試驗
　　按照腫瘤細胞的鑒定標準,分別對CB-23細胞株進行了生長曲線圖的繪制,染色體數(shù)目分析,克隆形成試驗,乳腺癌特異性抗體CA15-3的檢測,動物接種成瘤等五方面的鑒定試驗。結果顯示該乳腺腫瘤細胞株生長快,倍增時間短,染色體平均為97條,比正常犬的染色體78條(39對)數(shù)目要多,單個細胞的克隆形成率高,乳腺癌特異性抗體CA15-3呈強

6、陽性表達,小白鼠腫瘤細胞接種試驗的成瘤率100%。通過鑒定說明,培養(yǎng)的該犬乳腺腫瘤細胞株符合犬乳腺惡性腫瘤的特性,對其繼續(xù)培養(yǎng),有望建立犬乳腺腫瘤細胞系。本試驗為開展癌變機理和抗癌藥物的篩選等研究奠定了初步的基礎。
　　5.犬惡性乳腺腫瘤組織中ZNF703含量與分離細胞株培養(yǎng)效果相關性的分析研究
　　通過致癌基因ZNF703表達量與犬惡性乳腺腫瘤細胞株培養(yǎng)效果與傳代時間的相關性的分析結果顯示:癌組織中的ZNF703表達量相對