JNK信號傳導(dǎo)通路在星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧-復(fù)氧后的作用研究.pdf

1、目的：本課題通過研究分析缺氧/復(fù)氧后體外星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte，AC)的凋亡及通過特異性抑制劑阻斷JNK信號傳導(dǎo)通路后對凋亡的影響，從而探討JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在AC缺氧/復(fù)氧后凋亡中的作用，為臨床上缺血性腦卒中的神經(jīng)保護(hù)治療，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善卒中預(yù)后等提供理論依據(jù)。
　　方法：利用新生24小時內(nèi)的SD(Sprague Dawley)大鼠，取腦皮層新鮮腦組織，參照McCarthy等的方法進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astroc

2、yte，AC）原代培養(yǎng)，經(jīng)差速貼壁法提純后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。7-8天后傳代，傳至第3代，細(xì)胞自然純化，采用神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glia fibrillary acid protein，GFAP)免疫熒光鑒定AC，97％以上為陽性細(xì)胞，符合實驗要求。將AC分四組:1.正常對照組（N組）;2.正常抑制劑SP600125組（U組）;3.缺氧/復(fù)氧組（H/R組）;4.缺氧/復(fù)氧抑制劑組(H/R+U組)。采用特異性JNK磷酸化抑制劑SP6

3、00125，終濃度為10μmol/L，均在缺氧前30min加入，無阻滯劑組加入等量培養(yǎng)基。用三氣培養(yǎng)箱以95％N2、5％CO2造成細(xì)胞缺氧，建立AC缺氧/復(fù)氧模型并記錄缺氧時間。缺氧8小時后分別調(diào)節(jié)溫度37℃及32℃，開始記復(fù)氧時間。每組設(shè)復(fù)氧4h、6h、12h、24h4個時間點。將各組分別以MTT方法測定細(xì)胞活力，蛋白免疫印跡法（Western-blot）檢測JNK及p-JNK蛋白表達(dá)情況，ELISA法檢測TNF-α含量，采用Anne

4、xinV/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)雙染法應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡。采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果：1.體外純化培養(yǎng)AC及GFAP鑒定結(jié)果:AC傳至3代后，細(xì)胞突起較多而長，胞體較大而扁，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞核多偏于一側(cè)，多為橢圓形，GFAP+DAPI(4'，6-diamidino-2-phenylindole)免疫熒光雙標(biāo)顯示雙陽性細(xì)胞的胞質(zhì)為綠色，細(xì)胞核為藍(lán)色，結(jié)果顯示97％以上

5、。2.MTT法檢測細(xì)胞活力:(1)隨復(fù)氧時間延長細(xì)胞活力明顯下降，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);(2) H/R+U組較H/R組細(xì)胞活力增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。3.Western-blot半定量檢測結(jié)果:(1)各組間 JNK水平差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);(2) H/R組p-JNK缺氧復(fù)氧后表達(dá)量增多，并于復(fù)氧12h達(dá)到高峰，復(fù)氧24h開始下降;與N組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);(3) H/

6、R+U組與H/R組相比p-JNK被特異性抑制劑抑制，p-JNK表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。4.ELISA TNF-α檢測:(1)未給予缺氧復(fù)氧處理的N組與U組TNF-α水平無顯著變化;(2)H/R組缺氧后隨復(fù)氧時間延長TNF-α水平明顯升高，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);(3)用SP6000125阻斷JNK通路后，H/R+U組TNF-α水平較N組升高，較H/R組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。5

7、.流式細(xì)胞儀檢測AC凋亡結(jié)果:(1)缺氧復(fù)氧后AC的凋亡增加，N組比較凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(2)給予抑制劑阻斷JNK通路后，H/R+U組AC與H/R組比較凋亡減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：1.缺氧/復(fù)氧后AC出現(xiàn)不同程度的凋亡，并且AC活力也出現(xiàn)不同程度的下降。2.AC在缺氧復(fù)氧后，JNK信號通路較正常組有不同程度的激活。3.SP600125特異性阻斷JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后能夠減輕AC