白藜蘆醇對人膠質瘤及髓母細胞瘤細胞蛋白質組調節(jié)作用的初探.pdf

1、目的:人腦膠質瘤及髓母細胞瘤是臨床上常見的神經系統(tǒng)惡性腫瘤，均具有較高的侵襲性及擴散性，目前臨床上尚無有效治療手段，即使采用手術結合放化療也會給患者預后造成很大影響。有研究表明，藥物治療是提高患者生存質量的重要手段。白藜蘆醇是具有多種生物學功效的天然多酚類化合物，其抗腫瘤作用日趨受到重視，本課題旨在研究白藜蘆醇對腦腫瘤細胞系蛋白質組的影響，探討白藜蘆醇可能的作用機制及細胞系敏感性差異原因，尋找可能存在的抗腫瘤作用靶點或腫瘤耐藥機制，為深

2、入開展本領域研究、實現(xiàn)藥物臨床轉化及腫瘤個體化治療提供依據(jù)。實驗內容主要包括(1)蛋白質水平的影響:觀察對白藜蘆醇存在敏感性差異的不同腦腫瘤細胞系，在白藜蘆醇藥物處理前后，蛋白質組的改變。(2)篩選及鑒定:選取若干藥物處理前后存在差異表達的蛋白，運用質譜技術對其蛋白屬性加以鑒定。(3)差異蛋白質驗證:采用免疫組化和RT-PCR等方法，對鑒定出的蛋白在白藜蘆醇處理前后細胞中的表達進行核實。(4)數(shù)據(jù)整理分析:繪制可能存在的調控腫瘤生長的生

3、物網絡。
　　方法:(1)篩選與藥物處理:選取兩種腦腫瘤細胞系（膠質瘤及髓母細胞瘤），每種細胞系再分別選取對白藜蘆醇敏感性存在差異的細胞系（膠質瘤敏感型:U251、欠敏感型:LN18及髓母細胞瘤敏感型:UW228-3、欠敏感型:DAOY）。細胞系U251、LN18及UW228-3培養(yǎng)于低糖DMEM培養(yǎng)基(Low-Dulbecco's ModifiedEagle Medium，L-DMEM)中，DAOY培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基(

4、Roswell ParkMemorial Institute1640，RPMI1640)中，各培養(yǎng)基中分別含有10％胎牛血清和1％抗生素（青霉素和鏈霉素），藥物處理組用100μM的白藜蘆醇（Resveratrol，簡寫Res）處理48h，收取細胞片用HE染色觀察細胞形態(tài)。(2)蛋白雙向電泳分離及質譜鑒定:收取細胞提取全蛋白進行雙向凝膠電泳(two-dimensional gelelectrophoresis，2-DE)，蛋白質酶切技術對

5、變化差異點進行蛋白質酶切，質譜技術(mass spectrometry，MS)對酶切樣品進行質譜鑒定。(3)蛋白鑒定結果驗證:采用免疫細胞化學及免疫印跡技術對發(fā)現(xiàn)的新的蛋白結果進行驗證，采用RT-PCR技術對調節(jié)新蛋白表達的基因進行基因水平的驗證。
　　結果:(1)形態(tài)學改變:細胞系U251及UW228-3白藜蘆醇處理前后形態(tài)及數(shù)量上都有明顯的變化，均出現(xiàn)了神經元樣變化且細胞數(shù)量減少，而細胞系LN18及DAOY經過白藜蘆醇處理前后

6、，其形態(tài)和數(shù)量上幾乎沒有改變，提示:U251、UW228-3細胞系和LN18、DAOY細胞系對白藜蘆醇存在明顯敏感性差異。(2)蛋白質組學實驗:1）蛋白質組整體影響:主要以上調為主，膠質瘤細胞系中，U251實驗組，正常組N檢出310個蛋白點，對照組Res共檢出271個蛋白點，其中電腦軟件匹配結果共170個，上調比64.7％;在LN18細胞系中，正常組N檢出422個蛋白點，對照組Res共檢出405個蛋白點，電腦軟件匹配共269個，上調比6

7、4.3％。髓母細胞瘤細胞系中，DAOY組中，正常組N共檢出298個點，對照組Res共檢出342個點，軟件匹配234個，上調比42.7％; UW228-3組中，正常組N共檢出177個點，對照組Res共檢出118個點，軟件配對69個，上調比49.3％。2）差異蛋白質鑒定:蛋白質譜鑒定結果為烯醇化酶，磷酸甘油酸變位酶，角蛋白，膜聯(lián)蛋白，膜突蛋白，熱休克蛋白等。(3)差異蛋白質的驗證:隨機選取幾個蛋白進行RT-PCR驗證，ENO1、PDIA1、

8、AKR1B1等均表現(xiàn)為用藥后表達水平下降，而兩種角蛋白在兩種敏感性細胞系中幾乎未檢測到表達，在不敏感細胞系用藥后略有升高，CAP1在DAOY和U251中出現(xiàn)了上調，CAP1在UW228-3中下調明顯，在LN18中變化不明顯。(4)選取的表達共性的蛋白烯醇化酶ENO1的WB實驗結果與免疫細胞化學(ICC)實驗結果一致，均出現(xiàn)了藥物處理后下調，與雙向電泳結果符合。
　　結論:(1)初步得到了四種腦腫瘤細胞系白藜蘆醇處理前后蛋白質表達譜