白紋伊蚊嗅覺結(jié)合蛋白的克隆、鑒定和功能分析.pdf

1、研究背景:蚊是一類重要的醫(yī)學(xué)昆蟲，不僅叮咬騷擾人類，同時(shí)還可能傳播多種疾病，如瘧疾、絲蟲病、登革熱、流行性乙型腦炎、黃熱病等，對人類的健康產(chǎn)生極大的危害。蚊媒病流行范圍廣，傳播力強(qiáng)，發(fā)病率高，全球每年有上億人感染瘧疾、登革熱等蚊媒病，死亡人數(shù)過百萬。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在世界范圍內(nèi)，每年有成百上千萬人感染瘧疾，每年有多達(dá)一百萬的兒童死于瘧疾，瘧疾的流行給人類造成了巨大災(zāi)難并帶來難以承受的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。在我國每年也因?yàn)槲米拥亩ＲФl(fā)生多種疾病，蚊媒

2、傳染病仍然是威脅人們健康的主要因素之一[2，3]。媒介蚊蟲防制是控制蚊媒傳染病流行的重要措施。目前，對于登革熱、黃熱病、西尼羅病毒病等蚊媒病毒傳染病尚無特效治療方法或特異性預(yù)防手段，而瘧原蟲對傳統(tǒng)藥物抗藥性也逐漸凸顯，媒介控制在預(yù)防其發(fā)生和流行方面的重要性就顯得更加突出，而尋求有效的控制方法則成為世界醫(yī)學(xué)界面臨的重要課題。雖然媒介化學(xué)防制由于其突出的效果在蚊媒防制中一直占有統(tǒng)治地位，但是化學(xué)農(nóng)藥所造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，易引起蚊蟲藥物抗性的

3、產(chǎn)生等弊端日益顯現(xiàn)，因此，控制蚊蟲的種群數(shù)量和密度，從而減少蚊媒傳染病的發(fā)生率和死亡率則顯得意義重大。蚊蟲對周圍環(huán)境的識別，主要依賴于自身的感官系統(tǒng)，如嗅覺系統(tǒng)、味覺系統(tǒng)等。對嗅覺系統(tǒng)的深入研究，有利于我們了解蚊蟲的生活習(xí)性，同時(shí)也有利于我們探討各種不同的化合物對蚊蟲的趨避活性。
　　 白紋伊蚊要進(jìn)行生存與繁殖，其行為在很大程度上依賴于嗅覺系統(tǒng)。近年來，國際上在蚊嗅覺結(jié)合蛋白領(lǐng)域取得了一些突破性的進(jìn)展，如在致倦庫蚊（Culex

4、quinquefasciatus）、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)和埃及伊蚊(Aedesaegypti)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典OBPs(classic OBPs)分別有33，34和55個(gè)[4-6]。盡管如此，由于白紋伊蚊的基因組序列還未公布，限制了對該種蚊屬的全方位研究，尤其對白紋伊蚊嗅覺系統(tǒng)的研究，包括對嗅覺結(jié)合蛋白和嗅覺受體的了解都知之甚少。
　　 研究目的:本課題研究擬初步探討白紋伊蚊嗅覺系統(tǒng)的主要組成成分之一

5、—嗅覺結(jié)合蛋白(OBP)，通過實(shí)驗(yàn)室研究分析其分子結(jié)構(gòu)特征，掌握其時(shí)空特異性表達(dá)譜，探討其在白紋伊蚊嗅覺發(fā)生過程中的重要作用，闡明嗅覺結(jié)合蛋白對氣味分子的識別作用及其調(diào)控的分子機(jī)制，從而為新型的、環(huán)保的、高效的蚊引誘劑或驅(qū)避劑的篩選奠定科學(xué)的理論基礎(chǔ)。
　　 研究方法:
　　 1.對部分白紋伊蚊基因組DNA序列進(jìn)行測序分析（此部分由陳曉光教授等完成）;
　　 2.利用tBLASTn的方法，以埃及伊蚊OBPs的氨基

6、酸序列作為索引，對白紋伊蚊基因組DNA序列進(jìn)行同源比對比對分析;
　　 3.通過RACE法，利用巢式PCR(nest PCR)擴(kuò)增白紋伊蚊OBP的全長cDNA序列(包括其N端的非編碼序列(untranslated region，UTR)與C末端的PolyA終止序列）;
　　 4.對所獲得的白紋伊蚊OBPs進(jìn)行一系列的分子生物信息學(xué)分析，如預(yù)測OBPs的分子量、等電點(diǎn)(isoelectric points，IP)和N端的信

7、號肽(signal peptides，SP)及其長度;
　　 5.利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫分析OBP蛋白的保守結(jié)構(gòu)域(conserved domains database，CDD)及進(jìn)行氨基酸序列比對，分析它們的分子結(jié)構(gòu)特征;
　　 6.利用軟件MEGA4.0對白紋伊蚊OBP進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，分析它們與及埃及伊蚊、岡比亞按蚊、致倦庫蚊OBP的親緣關(guān)系;
　　 7.通過RT-PCR，分析白紋伊蚊OBP的組織特異性表達(dá)譜（觸

8、角、喙、下顎須、足和軀干），同時(shí)還分析了AalbOBP37和AalbOBP39的時(shí)間表達(dá)譜和性別特異性表達(dá)譜;
　　 8.構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-22(b)-OBP37和pET-22(b)-OBP39，并進(jìn)行PCR鑒定和測序分析;
　　 9.靶標(biāo)蛋白AalbOBP37和AalbOBP39的誘導(dǎo)表達(dá)、純化，并通過SDS-PAGE和western blot鑒定;
　　 10.通過軟件SwissPdb Viewer p

9、rogramme“Deep-View”分析靶標(biāo)蛋白OBP37和OBP39的3D空間結(jié)構(gòu);
　　 11.蛋白-熒光配體結(jié)合分析實(shí)驗(yàn)(Fluorescent binding assay)分析靶標(biāo)蛋白OBP37和OBP39與不同氣味分子的親和力，同時(shí)還分析靶標(biāo)蛋白OBP37和OBP39在不同pH環(huán)境中與配體吲哚(indole)的親和能力;
　　 12.通過胸腔注射靶標(biāo)基因OBP37和OBP39的dsRNA，進(jìn)行RNA干擾(RN

10、Ainterference，RNAi)，并通過熒光定量PCR檢測RNAi的效果;
　　 13.觸角電位（Electroantennogram，EAG）分析白紋伊蚊對不同化合物的識別能力;14.通過RNAi將靶標(biāo)基因OBP37和OBP39 knockdown以后，檢測RNAi前后白紋伊蚊EAG的改變;
　　 15.Y型迷滓管實(shí)驗(yàn)分析白紋伊蚊對不同化合物的行為反應(yīng);
　　 16.通過RNAi將靶標(biāo)基因OBP37和OB

11、P39 knockdown以后，Y型迷津管實(shí)驗(yàn)分析白紋伊蚊對氣味分子indole的識別能力是否有改變。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.通過測序，我們得到了部分白紋伊蚊的基因組DNA序列;
　　 2.得到了與埃及伊蚊OBP基因序列同源性最高的白紋伊蚊基因組DNA序列;
　　 3.以這些DNA序列作為模板，設(shè)計(jì)5'和3'RACE nest PCR引物;成功獲得了21個(gè)白紋伊蚊OBP基因的全長eDNA序列，包括5

12、'和3'非編碼基因序列;
　　 4.生物信息學(xué)分析得知:21個(gè)白紋伊蚊OBP基因都屬于小分子蛋白，分子量介于15 kDa～28 kDa之間;其中有14個(gè)OBPs基因含有信號肽，信號肽長度為17aa～25aa，而另外7個(gè)OBPs無信號肽;
　　 5.CDD分析可知含有信號肽的14個(gè)OBPs基因?qū)儆赑BP_GOBP家族;序列比對分析結(jié)果表明屬于PBP_GOBP家族的14個(gè)OBPs基因?yàn)榻?jīng)典的OBPs(classic OBPs

13、):即含有六個(gè)保守的半胱氨酸殘疾結(jié)構(gòu);而另外7個(gè)OBP基因?yàn)镻lus-C家族的OBPs:即六個(gè)保守的半胱氨酸殘基，還有2個(gè)額外的保守半胱氨酸殘基(C4a和C6a)一個(gè)保守的脯氨酸殘基;
　　 6.系統(tǒng)進(jìn)化樹分析可知白紋伊蚊與埃及伊蚊OBP的親緣關(guān)系最近，同時(shí)14個(gè)Classic OBP又被分為六個(gè)組:OS-E/OS-F組、PRPBP1組、PRPBP4組、GroupA組、Group B組和LUSH/OBP19a組，其中OBP37和

14、OBP39屬于OS-E/OS-F組;
　　 7.組織特異性表達(dá)譜結(jié)果顯示21個(gè)白紋伊蚊OBPs在不同的組織中的表達(dá)情況不同，其中OBP37和OBP39為觸角特異性表達(dá)的OBP;同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)OBP37和OBP39在白紋伊蚊羽化后第一、二天出現(xiàn)弱表達(dá)，且表達(dá)水平隨著時(shí)間的增加而升高;另外，OBP39在雌蚊觸角中的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在雄蚊，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(actin:t=-68.128，P＜0.001; rpS6:t=-11

15、.142，P=0.008)，而AalbOBP37在雌雄蚊觸角中的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(actin:t=0.214, P=0.085,rpS6: t=0.254, P=0.823);
　　 8.成功構(gòu)建表達(dá)載體pET-22(b)-OBP37和pET-22(b)-OBP39;
　　 9.成功誘導(dǎo)靶標(biāo)蛋白AalbOBP37和AalbOBP39在原核系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)，通過SDS-PAGE和western blot證實(shí):靶標(biāo)蛋白未被分泌至細(xì)

16、胞內(nèi)，在細(xì)菌體內(nèi)以兩種形式存在:同時(shí)以包涵體和可溶性蛋白的形式存在;成功回收經(jīng)鑒定的可溶性靶標(biāo)蛋白;
　　 10.通過軟件SwissPdb Viewer programme“Deep-View”分析靶標(biāo)蛋白OBP37和OBP39的空間結(jié)構(gòu)得知:白紋伊蚊OBP39的分子結(jié)構(gòu)與岡比亞按蚊、致倦庫蚊和埃及伊蚊的OBP1極為相似，故推測白紋伊蚊OBP39的功能與其它三屬蚊OBP的功能相似;白紋伊蚊OBP37的結(jié)構(gòu)與OBP39亦極為相似，

17、所以O(shè)BP37亦可能具有與OBP39相似的功能;
　　 11.通過Fluorescent binding assay，白紋伊蚊OBP37和OBP39能與配體吲哚(indole)、3-甲基吲哚(skatole)、避蚊胺(DEET)和1-辛烯-3-醇（1-octen-3-ol）結(jié)合;同時(shí)，OBP37和OBP39在酸性環(huán)境(pH=4.5)中與配體indole的結(jié)合力較中性環(huán)境(pH=7.4)弱;
　　 12.通過RNAi，成功

18、將靶標(biāo)基因AalbOBP37和AalbOBP39的表達(dá)水平knockdown;
　　 13.EAG結(jié)果顯示indole、skatole、DEET和1-octen-3-ol能夠觸發(fā)白紋伊蚊觸角產(chǎn)生動(dòng)作電位，且隨著化合物濃度的增加而增強(qiáng);
　　 14.通過RNAi成功knock down靶標(biāo)基因OBP37和OBP39的表達(dá)水平后，與對照組相比較，實(shí)驗(yàn)組的EAG顯著下降，總體差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.454，P＜0.

19、001);
　　 15.行為實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示indole、skatole和1-octen-3-ol對白紋伊蚊具有引誘作用，而DEET對白紋伊蚊具有趨避作用;
　　 16.通過RNAi成功knock down靶標(biāo)基因OBP37和OBP39的表達(dá)水平后，行為實(shí)驗(yàn)證實(shí)干擾組蚊蟲對氣味分子indole的趨化活性低于對照組，總體差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.465，P＜0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 1.首次

20、成功克隆、鑒定了21個(gè)白紋伊蚊OBP基因;
　　 2.靶標(biāo)蛋白OBP37和OBP39以包涵體和可溶性蛋白兩種形式存在于細(xì)菌體內(nèi);
　　 3.白紋伊蚊OBP的表達(dá)具有時(shí)空特異性;OBP37和OBP39屬于觸角特異性表達(dá)的OBPs;
　　 4.RNAi成功knock down白紋伊蚊OBP37和OBP39的表達(dá)水平;
　　 5.白紋伊蚊OBP37和OBP39與氣味分子的結(jié)合能力受到pH的影響;