白紋伊蚊嗅覺結合蛋白的克隆、鑒定和功能分析.pdf

1、研究背景:蚊是一類重要的醫(yī)學昆蟲，不僅叮咬騷擾人類，同時還可能傳播多種疾病，如瘧疾、絲蟲病、登革熱、流行性乙型腦炎、黃熱病等，對人類的健康產生極大的危害。蚊媒病流行范圍廣，傳播力強，發(fā)病率高，全球每年有上億人感染瘧疾、登革熱等蚊媒病，死亡人數過百萬。據統(tǒng)計，在世界范圍內，每年有成百上千萬人感染瘧疾，每年有多達一百萬的兒童死于瘧疾，瘧疾的流行給人類造成了巨大災難并帶來難以承受的經濟負擔[1]。在我國每年也因為蚊子的叮咬而發(fā)生多種疾病，蚊媒

2、傳染病仍然是威脅人們健康的主要因素之一[2，3]。媒介蚊蟲防制是控制蚊媒傳染病流行的重要措施。目前，對于登革熱、黃熱病、西尼羅病毒病等蚊媒病毒傳染病尚無特效治療方法或特異性預防手段，而瘧原蟲對傳統(tǒng)藥物抗藥性也逐漸凸顯，媒介控制在預防其發(fā)生和流行方面的重要性就顯得更加突出，而尋求有效的控制方法則成為世界醫(yī)學界面臨的重要課題。雖然媒介化學防制由于其突出的效果在蚊媒防制中一直占有統(tǒng)治地位，但是化學農藥所造成嚴重的環(huán)境污染，易引起蚊蟲藥物抗性的

3、產生等弊端日益顯現，因此，控制蚊蟲的種群數量和密度，從而減少蚊媒傳染病的發(fā)生率和死亡率則顯得意義重大。蚊蟲對周圍環(huán)境的識別，主要依賴于自身的感官系統(tǒng)，如嗅覺系統(tǒng)、味覺系統(tǒng)等。對嗅覺系統(tǒng)的深入研究，有利于我們了解蚊蟲的生活習性，同時也有利于我們探討各種不同的化合物對蚊蟲的趨避活性。
　　 白紋伊蚊要進行生存與繁殖，其行為在很大程度上依賴于嗅覺系統(tǒng)。近年來，國際上在蚊嗅覺結合蛋白領域取得了一些突破性的進展，如在致倦庫蚊（Culex

4、quinquefasciatus）、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)和埃及伊蚊(Aedesaegypti)中已經發(fā)現的經典OBPs(classic OBPs)分別有33，34和55個[4-6]。盡管如此，由于白紋伊蚊的基因組序列還未公布，限制了對該種蚊屬的全方位研究，尤其對白紋伊蚊嗅覺系統(tǒng)的研究，包括對嗅覺結合蛋白和嗅覺受體的了解都知之甚少。
　　 研究目的:本課題研究擬初步探討白紋伊蚊嗅覺系統(tǒng)的主要組成成分之一

5、—嗅覺結合蛋白(OBP)，通過實驗室研究分析其分子結構特征，掌握其時空特異性表達譜，探討其在白紋伊蚊嗅覺發(fā)生過程中的重要作用，闡明嗅覺結合蛋白對氣味分子的識別作用及其調控的分子機制，從而為新型的、環(huán)保的、高效的蚊引誘劑或驅避劑的篩選奠定科學的理論基礎。
　　 研究方法:
　　 1.對部分白紋伊蚊基因組DNA序列進行測序分析（此部分由陳曉光教授等完成）;
　　 2.利用tBLASTn的方法，以埃及伊蚊OBPs的氨基

6、酸序列作為索引，對白紋伊蚊基因組DNA序列進行同源比對比對分析;
　　 3.通過RACE法，利用巢式PCR(nest PCR)擴增白紋伊蚊OBP的全長cDNA序列(包括其N端的非編碼序列(untranslated region，UTR)與C末端的PolyA終止序列）;
　　 4.對所獲得的白紋伊蚊OBPs進行一系列的分子生物信息學分析，如預測OBPs的分子量、等電點(isoelectric points，IP)和N端的信

7、號肽(signal peptides，SP)及其長度;
　　 5.利用網絡數據庫分析OBP蛋白的保守結構域(conserved domains database，CDD)及進行氨基酸序列比對，分析它們的分子結構特征;
　　 6.利用軟件MEGA4.0對白紋伊蚊OBP進行系統(tǒng)進化樹分析，分析它們與及埃及伊蚊、岡比亞按蚊、致倦庫蚊OBP的親緣關系;
　　 7.通過RT-PCR，分析白紋伊蚊OBP的組織特異性表達譜（觸

8、角、喙、下顎須、足和軀干），同時還分析了AalbOBP37和AalbOBP39的時間表達譜和性別特異性表達譜;
　　 8.構建原核表達載體pET-22(b)-OBP37和pET-22(b)-OBP39，并進行PCR鑒定和測序分析;
　　 9.靶標蛋白AalbOBP37和AalbOBP39的誘導表達、純化，并通過SDS-PAGE和western blot鑒定;
　　 10.通過軟件SwissPdb Viewer p

9、rogramme“Deep-View”分析靶標蛋白OBP37和OBP39的3D空間結構;
　　 11.蛋白-熒光配體結合分析實驗(Fluorescent binding assay)分析靶標蛋白OBP37和OBP39與不同氣味分子的親和力，同時還分析靶標蛋白OBP37和OBP39在不同pH環(huán)境中與配體吲哚(indole)的親和能力;
　　 12.通過胸腔注射靶標基因OBP37和OBP39的dsRNA，進行RNA干擾(RN

10、Ainterference，RNAi)，并通過熒光定量PCR檢測RNAi的效果;
　　 13.觸角電位（Electroantennogram，EAG）分析白紋伊蚊對不同化合物的識別能力;14.通過RNAi將靶標基因OBP37和OBP39 knockdown以后，檢測RNAi前后白紋伊蚊EAG的改變;
　　 15.Y型迷滓管實驗分析白紋伊蚊對不同化合物的行為反應;
　　 16.通過RNAi將靶標基因OBP37和OB

11、P39 knockdown以后，Y型迷津管實驗分析白紋伊蚊對氣味分子indole的識別能力是否有改變。
　　 研究結果:
　　 1.通過測序，我們得到了部分白紋伊蚊的基因組DNA序列;
　　 2.得到了與埃及伊蚊OBP基因序列同源性最高的白紋伊蚊基因組DNA序列;
　　 3.以這些DNA序列作為模板，設計5'和3'RACE nest PCR引物;成功獲得了21個白紋伊蚊OBP基因的全長eDNA序列，包括5

12、'和3'非編碼基因序列;
　　 4.生物信息學分析得知:21個白紋伊蚊OBP基因都屬于小分子蛋白，分子量介于15 kDa～28 kDa之間;其中有14個OBPs基因含有信號肽，信號肽長度為17aa～25aa，而另外7個OBPs無信號肽;
　　 5.CDD分析可知含有信號肽的14個OBPs基因屬于PBP_GOBP家族;序列比對分析結果表明屬于PBP_GOBP家族的14個OBPs基因為經典的OBPs(classic OBPs

13、):即含有六個保守的半胱氨酸殘疾結構;而另外7個OBP基因為Plus-C家族的OBPs:即六個保守的半胱氨酸殘基，還有2個額外的保守半胱氨酸殘基(C4a和C6a)一個保守的脯氨酸殘基;
　　 6.系統(tǒng)進化樹分析可知白紋伊蚊與埃及伊蚊OBP的親緣關系最近，同時14個Classic OBP又被分為六個組:OS-E/OS-F組、PRPBP1組、PRPBP4組、GroupA組、Group B組和LUSH/OBP19a組，其中OBP37和

14、OBP39屬于OS-E/OS-F組;
　　 7.組織特異性表達譜結果顯示21個白紋伊蚊OBPs在不同的組織中的表達情況不同，其中OBP37和OBP39為觸角特異性表達的OBP;同時我們還發(fā)現OBP37和OBP39在白紋伊蚊羽化后第一、二天出現弱表達，且表達水平隨著時間的增加而升高;另外，OBP39在雌蚊觸角中的表達水平遠遠高于在雄蚊，差異顯著，具有統(tǒng)計學意義(actin:t=-68.128，P＜0.001; rpS6:t=-11

15、.142，P=0.008)，而AalbOBP37在雌雄蚊觸角中的表達無統(tǒng)計學差異(actin:t=0.214, P=0.085,rpS6: t=0.254, P=0.823);
　　 8.成功構建表達載體pET-22(b)-OBP37和pET-22(b)-OBP39;
　　 9.成功誘導靶標蛋白AalbOBP37和AalbOBP39在原核系統(tǒng)內表達，通過SDS-PAGE和western blot證實:靶標蛋白未被分泌至細

16、胞內，在細菌體內以兩種形式存在:同時以包涵體和可溶性蛋白的形式存在;成功回收經鑒定的可溶性靶標蛋白;
　　 10.通過軟件SwissPdb Viewer programme“Deep-View”分析靶標蛋白OBP37和OBP39的空間結構得知:白紋伊蚊OBP39的分子結構與岡比亞按蚊、致倦庫蚊和埃及伊蚊的OBP1極為相似，故推測白紋伊蚊OBP39的功能與其它三屬蚊OBP的功能相似;白紋伊蚊OBP37的結構與OBP39亦極為相似，

17、所以OBP37亦可能具有與OBP39相似的功能;
　　 11.通過Fluorescent binding assay，白紋伊蚊OBP37和OBP39能與配體吲哚(indole)、3-甲基吲哚(skatole)、避蚊胺(DEET)和1-辛烯-3-醇（1-octen-3-ol）結合;同時，OBP37和OBP39在酸性環(huán)境(pH=4.5)中與配體indole的結合力較中性環(huán)境(pH=7.4)弱;
　　 12.通過RNAi，成功

18、將靶標基因AalbOBP37和AalbOBP39的表達水平knockdown;
　　 13.EAG結果顯示indole、skatole、DEET和1-octen-3-ol能夠觸發(fā)白紋伊蚊觸角產生動作電位，且隨著化合物濃度的增加而增強;
　　 14.通過RNAi成功knock down靶標基因OBP37和OBP39的表達水平后，與對照組相比較，實驗組的EAG顯著下降，總體差異顯著，具有統(tǒng)計學意義(F=22.454，P＜0.

19、001);
　　 15.行為實驗結果顯示indole、skatole和1-octen-3-ol對白紋伊蚊具有引誘作用，而DEET對白紋伊蚊具有趨避作用;
　　 16.通過RNAi成功knock down靶標基因OBP37和OBP39的表達水平后，行為實驗證實干擾組蚊蟲對氣味分子indole的趨化活性低于對照組，總體差異顯著，具有統(tǒng)計學意義(F=22.465，P＜0.001)。
　　 結論:
　　 1.首次

20、成功克隆、鑒定了21個白紋伊蚊OBP基因;
　　 2.靶標蛋白OBP37和OBP39以包涵體和可溶性蛋白兩種形式存在于細菌體內;
　　 3.白紋伊蚊OBP的表達具有時空特異性;OBP37和OBP39屬于觸角特異性表達的OBPs;
　　 4.RNAi成功knock down白紋伊蚊OBP37和OBP39的表達水平;
　　 5.白紋伊蚊OBP37和OBP39與氣味分子的結合能力受到pH的影響;