驢新型Cathelicidin的基因克隆、多肽鑒定和功能分析.pdf

1、在此項(xiàng)研究中，為鑒定新型Cathelicidin抗微生物肽，我們以家畜驢為研究對象，構(gòu)建了驢肺臟cDNA文庫；使用半巢式PCR的方法，從該cDNA文庫中克隆得到兩種新型Cathelicidin家族抗微生物肽：Ea-CATH1和Ea-CATH2。它們分別由25（KRRGSVTTRYQFLMIHLLRPKKLFA）和26（KGRGSETTRYQFVPVHFFPWNKLS DF）個氨基酸殘基組成，與目前已鑒定的其它物種內(nèi)源性Cathelici

2、din抗微生物肽相比，沒有序列同源性。它們均是堿性多肽，分別含有7個和4個堿性氨基酸殘基；兩者的分子量均很小，分別為3060.75Da和3144.54 Da。
　　 在所篩選的32株細(xì)菌和真菌中，化學(xué)合成的EA-CATH1小肽對大部分菌株均有很強(qiáng)的殺菌活性，尤其是臨床分離的耐藥性菌株；Ea-CATH1對其中革蘭氏陽性菌的最小抑菌濃度（MIC）大多在0.3-2.4μg/ml范圍內(nèi)。Ea-CATH1的抗菌活性在人血清中表現(xiàn)相當(dāng)穩(wěn)定，

3、與血清在37℃孵育3天后，仍能發(fā)揮較強(qiáng)的抗菌能力；而且在高達(dá)20μg/ml的劑量下（遠(yuǎn)高于對應(yīng)的MIC），Ea-CATH1對人血紅細(xì)胞僅顯示極微弱的溶血性（1.8％）。
　　 圓二色譜顯示，Ea-CATH1在模擬生物膜結(jié)構(gòu)的50％TFE/H2O溶液中主要呈現(xiàn)α-螺旋結(jié)構(gòu)，但是在水溶液中主要采用無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。在體外，0.6μg/ml的Ea-CATH1可以在2小時內(nèi)徹底殺死10 6CFU/ml的金黃色葡萄球菌（ATCC2592），

4、遠(yuǎn)勝于傳統(tǒng)抗生素氨芐青霉素。利用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察經(jīng)Ea-CATH1處理半小時的金黃色葡萄球菌（ATCC2592），結(jié)果證明Ea-CATH1能迅速破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，從而導(dǎo)致細(xì)胞裂解，細(xì)菌死亡；這或許是由殺菌動力學(xué)數(shù)據(jù)揭示的Ea-CATH1殺菌速度比傳統(tǒng)抗生素快很多的原因。
　　 在CaCl2存在的條件下，Ea-CATH1表現(xiàn)明顯的紅細(xì)胞凝集活性，說明它可能抑制細(xì)菌分泌的多聚蛋白與宿主紅細(xì)胞表面相互作用，從而限制