miR-17-5p對大鼠BMMSCs增殖周期的調(diào)控作用研究.pdf

1、研究背景：
　　隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展,飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的變化,由此導致的血栓性疾病也成為全球健康的頭號殺手。其中冠心病(Coronary Heart Disease,CHD)的致死率約為13％左右,尤其是心肌梗死(Myocaridal Infarction,MI)的發(fā)生率呈上升趨勢,嚴重威脅了人類的壽命和生活質(zhì)量。而目前對冠心病的治療方式均無法從根本上挽救已經(jīng)壞死的心肌。一般認為,心肌細胞是終末期細胞,在心肌受到損害后無法自行修復

2、。如何挽救壞死的心肌細胞改善心臟功能成為當今研究的重點,近年來隨著對干細胞(Stem Cells)的研究發(fā)現(xiàn)將干細胞誘導分化為心肌細胞后可以修復梗死區(qū)域的壞死心肌并且能夠改善心功能,這一研究為終末期心臟病患者帶來了新的曙光。在干細胞中,骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMMSCs)以具有自我更新能力、多向分化潛能及易于獲得等特性而成為當今干細胞研究的熱點。但是隨著對干細胞的研究的深

3、入,研究者們發(fā)現(xiàn)干細胞在體外培養(yǎng)傳代時同其他體細胞一樣都存在著細胞衰老的現(xiàn)象,這一現(xiàn)象嚴重阻礙了干細胞的臨床應用,因此如何解決這一問題成為醫(yī)學研究者共同的目標。
　　研究目的：
　　1.探討大鼠BMMSCs體外分離培養(yǎng)、生長與傳代并觀察各代BMMSCs的增殖規(guī)律和特點。
　　2.明確miR-17-5p在衰老及正常大鼠BMMSCs中的表達變化規(guī)律與差異性。
　　3.研究miR-17-5p對大鼠BMMSCs增殖周期的

4、影響和調(diào)控作用。
　　研究方法：
　　1.細胞培養(yǎng)、細胞計數(shù)與鑒定:采用差速貼壁法聯(lián)合密度梯度離心法分離培養(yǎng)大鼠BMMSCs,并傳代純化培養(yǎng)至第10代。取第4代(P4)至第10代(P10)BMMSCs用流式細胞儀分別進行表面抗原CD29、CD44、CD45鑒定。倒置顯微鏡動態(tài)觀察各代細胞形態(tài)學的變化并記錄,將各代細胞進行計數(shù)并繪制增殖曲線。
　　2.BMMSCs細胞衰老檢測:取第4代(P4)BMMSCs至第10代(P1

5、0)BMMSCs用β-半乳糖苷酶(β-gal)染色法分別進行染色,以檢測出衰老細胞。
　　3.細胞轉(zhuǎn)染與MTT法:將P10BMMSCs接種于24孔板中,分為空白對照組(P10-CON),轉(zhuǎn)染試劑對照組(P10-Xtrem)實驗組(P10-mimics),每組細胞設有三個復孔,將miR-17-5p-mimics轉(zhuǎn)染入試驗組中,于細胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)48h后開始進行細胞計數(shù)及MTT法檢測,并繪制細胞增值曲線。
　　4.PCR技術(shù)及流式

6、細胞檢測技術(shù):采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測正常與衰老BMMSCs中miR-17-5p基因的表達情況及轉(zhuǎn)染48h后3組細胞中miR-17-5p的表達量,并用2(-ΔΔct)法定量分析。饑餓培養(yǎng)P10-CON組及P10-mimics組細胞,令其同時進入細胞周期后,使用流式細胞儀檢測兩組細胞的細胞周期。
　　研究結(jié)果：
　　1.各代BMMSCs形態(tài)學變化:P4至P10的BMMSCs細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,P4BMMS

7、Cs形態(tài)均一,呈典型的漩渦狀生長,P10BMMSCs失去典型的梭形外觀,細胞體積增大而不規(guī)則,形狀扁平,細胞間隙增大,出現(xiàn)衰老現(xiàn)象。流式細胞儀檢測P4至P10BMMSCs表面標志抗原CD44和CD45,結(jié)果顯示:各代BMMSCs的CD44陽性表達率90%以上,CD45陽性表達率為3%以下。
　　2.細胞生長曲線及增殖規(guī)律:P4-P10BMMSCs及P10-mimics組細胞生長曲線,均呈S形。第1、2d細胞生長緩慢,為潛伏期;第3

8、-5天細胞增殖加速,數(shù)目呈指數(shù)級增長繁殖,為對數(shù)生長期;培養(yǎng)第6d細胞數(shù)目達峰值,增殖速度減慢進入平臺期,細胞數(shù)目相對穩(wěn)定;P4-8BMMSCs增殖良好,P9-10BMMSCs增殖不良,第6天,P10最為顯著(P<0.05)。P10-mimics組在接種24h后細胞數(shù)量無明顯改變,細胞處于停滯期,在對數(shù)生長期時,P10-mimics組生長最快(P<0.05),P10-mimics組在第7d時細胞數(shù)量仍在繼續(xù)緩慢的增長。
　　3.B

9、MMSCs細胞衰老檢測:P9至P10BMMSCs經(jīng)β-gal半乳糖苷酶染色呈藍色(陽性),提示此時細胞為衰老細胞。P4至P8BMMSCs經(jīng)染色β-gal半乳糖苷酶染色后未著色(陰性),提示此時細胞為正常細胞。
　　4.BMMSCsmiR-17-5p基因的表達狀況:P4BMMSCsmiR-17-5p基因的表達量是(2.7784±0.1052)bp為P10BMMSCs中的6.5倍(P<0.01)。細胞轉(zhuǎn)染48h后,P10-mimics

10、組miR-17-5p表達量是(1.32365±0.231)bp為P10-CON中的2.9倍(P<0.05)。
　　5.miR-17-5p對BMMSCs細胞周期的影響:饑餓培養(yǎng)48h后添加血清,3組細胞G0/G1期細胞百分比分別降低了P10-CON組53.16%、P10-Xtrem組50.64%和P10-mimics組51.47%,且三組之間無明顯差異(P>0.05);3組S期細胞均有升高,可見有G0/G1期細胞進入S期,以P10-

11、mimics組最為顯著(P<0.05)。P10-mimics組細胞從G0/G1期順利進入S期,促進細胞生長增殖;3組細胞從S期進入G2期,以P10-mimics組最為顯著(P<0.05);3組細胞增殖指數(shù)分別為P10-CON組65.44%,P10-Xtrem組54.405%和P10-mimics組83.85%,P10-mimics組約為P10-CON組的1.28倍,(P<0.05),說明P10-mimics組的增殖能力強。
　　研

12、究結(jié)論：
　　1.利用差速貼壁聯(lián)合密度梯度離心的分離方法,能獲得較高純度的BMMSCs,通過檢測BMMSCs的表面抗原可以鑒定,BMMSCs在體外多次傳代的過程中可以保持較高的純度。
　　2.衰老BMMSCs中miR-17-5p的表達量顯著降低,提示miR-17-5p可能參與了細胞的衰老過程。
　　3.miR-17-5p能夠促使BMMSCs由G0/G1期進入S期,改變細胞周期,從而提高細胞的增殖能力延緩細胞衰老狀態(tài)和進