周期素依賴性蛋白激酶抑制劑3′單肟靛玉紅對Alzheimer病治療的實驗研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年期癡呆的最常見的類型，其臨床特點包括記憶力障礙、認知功能損害及行為異常。AD的發(fā)病率隨著年齡的增加而上升。AD給家庭和社會帶來沉重的負擔，已經成為一個嚴重的社會和醫(yī)療問題。但是到目前為止，AD的發(fā)病機制尚不完全清楚，臨床缺乏理想的治療藥物。因此，研究AD的發(fā)病機制及研發(fā)有效的防治藥物顯得尤為重要。 AD病理上以大腦出現(xiàn)細胞外老年斑(senile plaques，S

2、P)、細胞內神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTS)和神經元及突觸減少為特征，特定區(qū)域神經元的喪失不僅是腦萎縮的形態(tài)學基礎，還是引起患者臨床學習和記憶障礙的關鍵。越來越多的證據顯示，AD發(fā)病過程中周期素依賴性蛋白激酶(cyclin-dendent kinases，Cdl(s)的異常激活可以導致細胞周期紊亂，誘發(fā)神經細胞死亡。 Cdks抑制劑最早用于癌癥的治療，最近已經有利用Cdks抑制劑作為神經

3、保護劑的研究報道，但是大部分資料來自體外細胞培養(yǎng)實驗，僅有少數研究來自神經變性和凋亡動物模型。雖然Cdks抑制劑治療AD的可能機制尚不完全清楚，但是cdks抑制劑已經用于研究異常的Cdks活性與神經變性性疾病的關系。Cdks抑制劑極可能成為治療AD的重要靶標。 靛玉紅(indimbin)是中國醫(yī)學家們在傳統(tǒng)中成藥當歸蘆薈丸中發(fā)現(xiàn)抗腫瘤有效成分。目前已經清楚靛玉紅是一種選擇性的IgNCdks抑制劑，它可以在納摩爾水平抑制Cdk1、

4、Cdk2、Cdk5的活性，但其水溶性和脂溶性都很差，且有一定的肝毒性。然而，靛玉紅的衍生物：3，單肟靛玉紅(Indimbin-3’-monoxime，IMX)，不僅是強有力的Cdks抑制劑，而且毒性低、分子量小、有較好的膜通透性，IMx可以與ATP競爭Cdks激酶的催化位點。本文工作旨在研究Cdks在Aβ<,1-40>誘導的AD動物模型中表達情況，并在此基礎上研究Cdks抑制劑IMx對AD動物模型的實驗性治療作用。本實驗不僅為AD的治療

5、探索新的途徑和尋找有效的新藥物，也為把IMx研發(fā)成臨床新藥積累實驗基礎。本文包括以下三部分工作： 第一部分 Cdk4和cyclin B1在AD動物模型中的表達分析 目的：研究周期素依賴性蛋白激酶和周期素在Ap<,1-40>誘導的AD動物模型中的表達及其與神經元凋亡的關系。 方法：應用Ap<,1-40>側腦室內持續(xù)給藥建立AD大鼠模型；應用免疫組織化學檢測周期素依賴性蛋白激酶CdK4和周期素cyclin B1的表達

6、；應用TUNEL方法檢測神經元的凋亡；應用熒光雙標的方法確定cdk4表達的細胞類型，同時還進行了Cdk4}Lcyclin B1與TUNEL的熒光雙標實驗。 結果：(1)Cdk4和cyclin B1于造模后7天就達較高水平，21天達高峰，直到28天仍然持續(xù)表達；(2)AD動物模型組TUNEL陽性細胞于造模后14天開始出現(xiàn)，21天達高峰并且少量持續(xù)存在；(3)存在cdk4與神經元標志性抗體的雙標陽性細胞；(4)發(fā)現(xiàn)Cdk4和cycl

7、in B1與TUNEL的雙標陽性細胞。 結論：Cdks參與了Ap毒性引起的神經元凋亡機制，Cdks抑制劑可能減少神經元凋亡的發(fā)生。 第二部分 Cdks抑制劑3’單肟靛玉紅的藥物代謝動力學研究 目的：本實驗研究IMx在體內的藥物代謝動力學過程及其能否進入腦內，為其臨床應用提供了理論依據。 方法：利用高效液相色譜法(HPLC)測定大鼠血液中IMX的含量；分別研究靜脈注射、腹腔注射兩種給藥途徑后，IMX在大鼠體

8、內的藥物代謝動力學特點，應用3P87藥物代謝動力學程序，計算出主要的藥物代謝動力學參數；并進一步觀察了靜脈給藥后藥物在動物體內主要器官心、肺、腎、腦組織中IMX的含量。 結果：(1)鼠尾靜脈注射IMX，藥物代謝動力學符合二室模型。IMX在鼠體內吸收快，分布也快，藥物起效快，在體內主要以消除過程為主，藥物在體內滯留時間較長；(2)腹腔注射IMX后，在150min血藥濃度達峰值。靜脈注射10 mg/kg IMX，于不同時間處死，用H

9、PLC測定各組織中IMX的含量，結果發(fā)現(xiàn)：I-ND(在心臟組織中含量較高，在1h達峰值；腦組織、肺組織中IMx含量在O.5h即達峰值；腎臟組織中IMx含量在3h達峰值，結合其化學結構特征推測，IMX易于透過血腦脊液屏障，以被動擴散為主，IMX主要分布在體循環(huán)和血流豐富的臟器中。 結論：應用HPLC法測定大鼠血漿中IMx的濃度，操作簡便、省時、精密度及重現(xiàn)性均較好。靜脈注射IMX，藥物代謝動力學符合二室模型，IMx在鼠血中主要以消

10、除過程為主，IMX主要分布在血流豐富的組織中，分布速率較快。IMX易于透過血腦脊液屏障，以被動擴散為主。 第三部分 IMx對AD動物模型行為學的影響及其神經保護機制研究 目的：研究IMX對AD大鼠神經元凋亡和學習記憶功能的影響及可能的神經保護機制。 方法：應用Ap<,1-40>側腦室給藥建立AD大鼠模型。成年健康雄性SD大鼠40只，隨機分成：假手術組、AD模型組、IMX干預組Ⅰ(7.5mg/Kg i．p．)、IM

11、X干預組Ⅱ(15mg/g i．p．)。IMX干預組在造模前1天經腹腔給藥。造模后第7、14、21天行Morris水迷宮實驗觀測大鼠的學習和記憶功能的改變；行為學測試結束后應用組織切片原位末端標記(TUNEL)技術對額顳葉皮層和海馬CA1區(qū)神經元的凋亡進行分析；應用Western blotting技術檢測Cdk4和周期素cyclin B1的表達；同時還觀察IMX對Cdc2激酶和ChAT活性的影響。 結果：(1)Morris水迷宮實

12、驗顯示IMX治療組Ⅰ和IMX治療組Ⅱ大鼠的平均逃避潛伏期分別為58.7±6.34s和48.8 ±7.83s較AD模型組(66.9±6.52s)明顯縮短，t=2.85(IMX治療組Ⅰ，P

13、百分率為35.88±6.26％和11.21 ±2.15％；(3)IMX干預組Ⅰ大鼠的皮層和海馬CAl區(qū)神經元凋亡百分率為13.22 ±5.23％和3.65±O.75％，低于AD模型組；IMX干預組Ⅱ大鼠的皮層和海馬CA1區(qū)神經元凋亡百分率為11.91±3.34％和2.58 ±O.57％，低于AD模型組；(4)與AD模型組相比，IMX干預組Cdk4和cyclin B1的表達減少、Cdc2激酶活性下降和ChAT活性升高。 結論：Cd