人cAMP依賴型蛋白激酶抑制劑β與人ERp29的克隆、表達純化和結構研究.pdf

1、本論文研究包括二部分：(1)人cAMP依賴型蛋白激酶β抑制劑(PKIβ)的表達純化和結構功能研究(2)人ERp29的克隆、表達純化以及結構和功能研究。 人cAMP依賴型蛋白激酶β抑制劑(PKIβ)是一種新的耐熱蛋白，它由78個氨基酸殘基組成，理論分子量為8648．2道爾頓，等電點為4．69．實驗證明，人cAMP依賴型蛋白激酶β抑制劑是對PKA催化亞基(C)具有抑制作用的蛋白之一。人腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織間的差異表達表明人PKIB基

2、因可能與人腦膠質(zhì)瘤的形成與人腦的發(fā)育過程有關。 為了表征人PKIβ結構特征和更好地了解它的生物學功能，首先，我們利用2D1HCOSY，TOCSY和NOESY等二維核磁共振技術，在BrukerDMX500核磁共振儀上，用TPPI方法純吸收模式，測得了人PKIβ的一系列二維核磁共振譜圖，得到了部分結構信息。 在此基礎上，我們以M9培養(yǎng)基為介質(zhì)，用15N標記人PKIβ，通過高表達和純化，得到了15N均勻標記的人PKIβ樣品，在

3、500兆核磁共振儀上分別對樣品進行了2D15N-1HHSQC，2D15N-1HHSQC-TCOSY，2D15N-1HHSOC—NOESY和3D15N-1HHSQC—NOESY等NMR實驗，我們采用“自旋體系識別”和“序列歸屬”的方法對15N均勻標記的人PKIβ的上述NMR譜峰進行了歸屬，大約90％的15N和1HN峰已經(jīng)得到歸屬。在上述工作的基礎上，我們用化學位移標志(CSI)方法識別人PKIβ的二級結構單元并確定了它們的序列位置。該結果

4、與我們之前用CD和FTIR獲得的數(shù)據(jù)基本一致。與野兔PKIQNMR實驗結果的比較顯示，人PKIβ很可能也是由具有抑制功能和出核信號功能的二個結構非常相似的結構域組成。 目前我們正試圖表達和純化一定量的PKAC樣品，深入研究15N標記的人PKIβ與PKAC之問的相互作用關系和特點，以期發(fā)現(xiàn)人PKIβ新的功能。 ERp29是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)一種重要蛋白，研究表明它在動物細胞內(nèi)發(fā)揮著重要的作用，可能具有幫助分泌蛋白折疊和起著分子伴侶的

5、功能。本論文用細菌表達系統(tǒng)克隆、表達和純化出大量的人ERp29蛋白，并用圓二色譜(CD)、傅立葉紅外光譜(FTIR)和拉曼(Raman)光譜對其二級結構進行了測量，結果表明人ERp29主要以α螺旋結構為主，其二級結構相對含量為：α螺旋大約為45％，β折疊約為22％，β轉(zhuǎn)角約為15％，無規(guī)卷曲結構約為18％。此外，我們還采用圓二色譜(CD)和傅立葉紅外光譜對人ERp29的熱穩(wěn)定性進行了研究，發(fā)現(xiàn)人ERp29在50℃以下，二級結構很穩(wěn)定，幾