來源于肝癌門靜脈癌栓的肝癌細胞系的建立及其生物學特性研究.pdf

1、目的: 建立來源于門靜脈癌栓的肝癌細胞系，并對其生物學特性進行分析，為研究門靜脈癌栓形成機制提供實驗材料。 方法: 第一部分：來源于門靜脈癌栓的人肝癌細胞系CSQT-1的建立 膠原酶消化法對活體人肝癌標本及門靜脈癌栓標本進行原代培養(yǎng)；采用挑取克隆細胞島擴大培養(yǎng)、自然純化法行單一肝癌細胞純化；光學顯微鏡觀察細胞生長情況；胰蛋白酶法消化傳代培養(yǎng)細胞；采用慢凍和快融進行細胞的凍存和復蘇。 第二部分：人肝

2、癌細胞系CSQT-1的生物學特性鑒定 細胞形態(tài)學觀察采用光鏡觀察；超微結構用電鏡觀察；胎盤藍染色計數(shù)檢測凍存后復蘇存活率；細胞計數(shù)法測定貼壁率；MTT法測細胞生長期曲線；流式細胞儀分析細胞周期和DNA組成；常規(guī)制備染色體標本，拍照分析核型；克隆形成實驗檢測細胞克隆形成率；裸鼠皮下接種CSQT-1細胞懸液，接種后觀察成瘤情況，計算異種移植率；透射電子顯微鏡鑒定細胞系的污染情況。 第三部分：構建人肝癌門靜脈癌栓裸鼠模型及細胞

3、系CSQT-2的建立和特點分析 將人肝癌門靜脈癌栓新鮮組織接種到裸鼠肝臟包膜下，形成移植瘤，然后利用移植瘤過繼傳代到裸鼠肝臟，經過5次傳代后，移植瘤生長比較穩(wěn)定。取裸鼠移植瘤，采用膠原酶消化法以及挑取克隆細胞島擴大培養(yǎng)、自然純化法行單一肝癌細胞純化新建細胞系。對該新建細胞系進行生物學特性分析，將裸鼠成瘤的肝臟用石蠟包埋后制成標本，并使用HE染色后觀察有無裸鼠門靜脈鏡下微癌栓的出現(xiàn)。 結果: 第一部分：細胞原代培養(yǎng)

4、早期，生長比較不穩(wěn)定，10代以前細胞傳代培養(yǎng)時需要較高的接種密度，而且細胞倍增時間不同。到第15代時細胞生長已比較穩(wěn)定。細胞呈上皮樣，大小不一，以多角形、多邊形為主，占90％以上。細胞在高密度時(＞2×106/mL)可見重疊及堆積生長。傳代時間一般為2-3天。 第二部分：CSQT-1細胞生物學特性鑒定 利用人肝癌門靜脈癌栓新鮮組織塊進行原代培養(yǎng)起來的細胞系CSQT-1，掃描電鏡顯示細胞表面豐富微絨毛，細胞大小不等，直徑在

5、10-20um之間，透射電鏡下見細胞以不規(guī)則型為主，細胞間有橋粒緊密連接等，有少量連接復合；細胞間有形成腺結構及條索結構傾向，可形成類似膽小管結構；細胞質豐富，有大量糖原顆粒形成糖原湖樣結構；線粒體、粗面內質網(wǎng)較發(fā)達，有豐富的游離核糖體；細胞長滿瓶底后，有重疊現(xiàn)象細胞失去接觸抑制生長核質比例倒置等。凍存后復蘇成活率為95％。細胞生長曲線顯示上皮樣惡性腫瘤生長特性，細胞群體倍增時間為48h，4h后貼壁率已超過90％，細胞軟瓊脂中生長，克隆

6、形成率為20％。DNA周期分析：G0/G1為64％，G2/M為19％，S為10％。染色體眾數(shù)以亞四倍體為主。細胞培養(yǎng)上清液AFP陰性，HBsAg陰性。CSQT-1細胞能在裸鼠中的成瘤。透射電鏡檢CSQT-1細胞無支原體污染。 第三部分：通過裸鼠皮下移植瘤及外科原位接種的方法建立了人肝癌門靜脈癌栓裸鼠皮下移植瘤模型和人肝癌門靜脈癌栓原位移植模型，并且在該肝臟腫瘤組織中成功培養(yǎng)出CSQT-2細胞系。通過對該細胞系進行核型分析及光電鏡

7、分析顯示其起源于人肝癌門靜脈癌栓組織，并且從其成瘤的肝臟中找到了鏡下門靜脈微癌栓的證據(jù)。 結論: 1.由人肝癌門靜脈癌栓組織培養(yǎng)的CSQT-1細胞系和通過裸鼠原位移植瘤培養(yǎng)的CSQT-2細胞系均能穩(wěn)定生長，具有無限生長的能力。該細胞系保持了來源組織的一些特性，AFP和HBsAg陰性，細胞間有形成腺結構及條索結構傾向。 2.來源于人肝癌門靜脈癌栓的肝癌細胞系和其他人肝癌細胞系相比，有其不同的生物學特性，主要表現(xiàn)為：

8、①直接來源于人肝癌門靜脈癌栓組織或者裸鼠原位移植瘤；②生長較迅速，貼壁快，細胞倍增時間分別為48h和36h；③AFP陰性，而大多數(shù)人癌細胞系的AFP為陽性。④一定數(shù)量的細胞種植于裸鼠后能形成腫瘤，且腫瘤隨著時間生長迅速；⑤生物學特性穩(wěn)定，對不同代細胞的生長特性、腫瘤標記物和與肝癌干細胞標記物CD133陽性率檢測結果，未顯示有明顯變化。⑥來源于人門靜脈癌栓的細胞系也具有在裸鼠形成門靜脈癌栓的能力。因此，CSQT-1及CSQT-2是兩株新建