SOST基因—9247 T-C多態(tài)的功能及表達調控研究.pdf

1、SOST基因(sclerostin，SOST)位于人類基因組的17q12-21，主要在骨細胞中表達，含有兩個外顯子和一個內含子，編碼硬化蛋白。硬化蛋白是一種糖蛋白，是骨形成的一個負調節(jié)者，SOST基因敲除的小鼠骨密度顯著增加。SOST基因突變引起以骨密度增加為特征的硬縮癥Van Buchem和鞏膜固化(Sclerosteosis)，Dutch VanBuchem則是SOST基因下游35kb處一個52kb的缺失引起的。
　　 我們

2、先前發(fā)現SOST基因-9247的順式調節(jié)多態(tài)性T/C(rs1230399)與骨密度顯著關聯。計算分析表明rs1230399位于兩個協同轉錄因子FOXA1和C/EBPα的中心識別區(qū)域。T/C多態(tài)影響FOXA1和C/EBPα與SOST基因DNA序列的結合，這個生物信息學的分析結果需要用實驗的方法加以證明。
　　 研究DNA與蛋白質互作的方法主要有凝膠電泳遷移率實驗(Electrophoreticmobility shift assa

3、y，EMSA)、染色質免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation，CHIP)實驗和反轉錄PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)等實驗方法。本研究的目的就是通過EMSA、CHIP實驗證明SNP位點rs1230399 T/C多態(tài)對SOST基因表達和轉錄因子FOXA1結合的影響。本研究結果將對全面理解rs1230399T/C多態(tài)的功能和

4、SOST基因的表達調控有重要意義，也為揭示骨質疏松癥的發(fā)病機理提供一定的理論依據。
　　 人骨肉瘤SAOS-2細胞是研究SOST基因表達的一個比較好的細胞系，本研究以SAOS-2細胞為材料，先以Western Blot方法確定該細胞中有FOXA1蛋白的表達，再分別通過細胞外實驗EMSA和細胞內實驗CHIP兩個方法來研究rs1230399 T/C多態(tài)對SOST基因表達和轉錄因子FOXA1結合的影響。
　　 通過多次實驗，E

5、MSA結果顯示我們所設計的含有T/C的探針所結合的蛋白不是我們預期的FOXA1蛋白，T/C與轉錄因子的結合都沒有明顯差異，在進一步用CHIP實驗重復時也沒有得到與轉錄因子結合的DNA序列片段。
　　 通過RT-PCR方法研究SOST基因的本底表達，經過多次引物設計摸索中擴增出了SOST基因，實驗結果表明SOST基因在SAOS-2細胞中表達量偏低。用10μM和1μM雌激素處理24h后，SOST基因和FOXA1基因轉錄水平的表達量都