WNT4基因在子宮內膜異位癥發(fā)生發(fā)展中的作用研究.pdf

1、目的:
　　子宮內膜異位癥(Endometriosis，EMs)簡稱內異癥，是子宮腔以外存在有功能的子宮內膜腺體和間質而引起的疾病，為育齡婦女的常見病，其發(fā)病率呈上升趨勢，發(fā)病機制至今仍尚無定論。目前研究表明，內異癥患者在位內膜細胞黏附、侵襲、血管形成能力增強，可能為內異癥發(fā)病的源頭[1]，但目前關于內異癥發(fā)病的在位內膜特異性基因仍不明確。
　　WNT基因是高度保守的發(fā)育基因的大家族，是重要的細胞信號分子，WNT基因及其下游

2、通路與細胞分化、增殖、凋亡、轉移有關[2]，參與了各種疾病甚至腫瘤的發(fā)病過程[3.4]。WNT的功能與內異癥的生物學行為有共同點，故WNT途徑有可能與內異癥發(fā)病有關，目前相關研究還很少。WNT4為WNT配體家族的一員，是一種局部作用的信號分子，參與細胞分化、增殖、轉移等，與細胞凋亡有關[5]，WNT4本身在正常子宮內膜組織中表達，與子宮內膜的增殖、蛻膜化、著床等功能有關[6-8]，內異癥為內膜性病變，當內膜中生理狀態(tài)WNT基因表達發(fā)生改

3、變時可能引起內異癥的發(fā)生，本課題組前期對內異癥在位內膜基因表達譜篩查結果發(fā)現(xiàn)內異癥組在位內膜WNT4基因表達明顯下調，由此我們推測，WNT4基因在在位內膜中的表達異常可能參與了內異癥的發(fā)病，但需要大樣本病例進行驗證，此外，WNT4在內異癥發(fā)病過程中如何發(fā)揮作用，是否通過調控細胞增殖、侵襲及凋亡而參與了內異癥的發(fā)病還需要進一步研究。
　　方法:
　　一、WNT4在子宮內膜異位癥異位病灶及在位內膜中的表達意義
　　1、應用

4、熒光定量PCR(Real Time PCR)方法檢測內異癥異位病灶及在位內膜中WNT4 mRNA的表達水平;
　　2、應用免疫組化及蛋白免疫印跡技術(Western blotting)檢測內異癥異位病灶及在位內膜中WNT4蛋白表達。
　　二、WNT4基因在子宮內膜異位癥在位內膜間質細胞(ESC)中的表達及對其生物學活性的影響作用
　　1、原代培養(yǎng)ESC及對照組在位內膜間質細胞(NSC)。
　　2、免疫細胞化學染色

5、鑒定細胞。
　　3、構建pEGFP-N1-WNT4重組質粒轉染ESC。
　　4、靶向NSC中WNT4基因的RNA干擾:構建3個WNT4 shRNA表達載體pGCsi-WNT4-s1、pGCsi-WNT4-s2和pGCsi-WNT4-s3。
　　5、Real time PCR檢測轉染W(wǎng)NT4基因重組質粒及WNT4 RNA干擾質粒后ESC和NSC中WNT4 mRNA表達水平。
　　6、Western Blotting

6、檢測轉染W(wǎng)NT4重組質粒及WNT4 RNA干擾質粒后ESC和NSC中WNT4蛋白表達水平。
　　7、CCK-8細胞增殖實驗檢測WNT4基因表達改變前后各組細胞增殖能力的改變。
　　8、應用AnnexinⅤ-APC/7-AAD凋亡檢測試劑盒檢測WNT4基因表達改變前后各組細胞凋亡率的改變。
　　9、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測WNT4表達改變前后MMP-9在培養(yǎng)上清中的含量變化。
　　結果:
　　一、W

7、NT4在子宮內膜異位癥異位病灶及在位內膜中的表達
　　1、Real time PCR結果顯示，將對照組子宮內膜WNT4 mRNA相對表達水平的平均值設為1，相對于此平均值，內異癥組在位內膜(EMs)和異位病灶(Ec)中WNT4 mRNA相對表達水平(2-ΔΔCt)分別為0.64±0.07(P＜0.01)和0.62±0.05(P＜0.01)，明顯低于對照組子宮內膜1.04±0.12，差異具有統(tǒng)計學意義。內異癥組增殖期(PE)和分泌期

8、(SE)內膜WNT4 mRNA相對表達水平分別與對照組增殖期和分泌期內膜比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。內異癥組在位內膜和異位病灶中WNT4 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2、免疫組化實驗表明WNT4在子宮內膜組織的腺體和間質細胞都表達，內異癥在位內膜和異位內膜WNT4蛋白表達陽性率分別為36.7％和30.0％，明顯低于對照組子宮內膜，66.7％(P＜0.05)。內異癥組增殖期和分泌期在位內膜WN

9、T4蛋白表達陽性率明顯低于對照組增殖期和分泌期子宮內膜(P＜0.05)。內異癥在位內膜和異位內膜WNT4蛋白表達陽性率差別無統(tǒng)計學意義，同組內增殖期和分泌期比較差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　3、Western blotting結果顯示:將對照組子宮內膜WNT4蛋白相對表達水平的平均值設為1，相對于此平均值，內異癥在位內膜組(EMs)和異位病灶(Ec)WNT4蛋白相對表達水平分別為0.60±0.13和0.62±0.10，低

10、于對照組子宮內膜1.00±0.14(P＜0.05)。內異癥組增殖期(PE)和分泌期(SE)內膜WNT4蛋白相對表達水平分別與對照組增殖期和分泌期內膜比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。內異癥組在位內膜和異位病灶中WNT4蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　二、WNT4基因在子宮內膜異位癥在位內膜間質細胞(ESC)中的表達及對其生物學活性的影響作用
　　1、體外成功分離和培養(yǎng)了子宮內膜異位癥在位內膜間質細胞

11、(ESC)及正常內膜間質細胞(NSC)。
　　2、免疫細胞化學染色鑒定結果表明細胞波形蛋白染色陽性，CD10染色陽性，角蛋白、Ⅷ因子及白細胞共同抗原染色均陰性，證實為子宮內膜間質細胞。
　　3、構建了三個靶向WNT4基因的shRNA表達載體pGCsi-WNT4-s1、pGCsi-WNT4-s2和pGCsi-WNT4-s3及pEGFP-N1-WNT4重組質粒。
　　4、實時熒光定量PCR結果顯示:基礎狀態(tài)下，ESC組WN

12、T4 mRNA相對水平（2-ΔΔCt，0.67±0.04）明顯低于NSC組（1.02±0.11），P＜0.01。ESC轉染pEGFP-N1-WNT4質粒組WNT4 mRNA相對水平為0.94±0.11，顯著高于ESC組(P＜0.05)。ESC轉染pEGFP-N1-V質粒組WNT4 mRNA相對水平為0.66±0.06，與ESC組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。pGCsi-WNT4-s1、pGCsi-WNT4-s2和pGCsi-WN

13、T4-s3組WNT4 mRNA相對水平分別為0.55±0.06、0.71±0.07和0.70±0.06，與NSC組比較明顯降低(P＜0.05)。其中pGCsi-WNT4-s1組WNT4mRNA相對水平最低(P＜0.01)。 NSC轉染pGCsi-V質粒組WNT4 mRNA相對水平為0.99±0.11，與NSC組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　5、蛋白免疫印跡結果顯示:基礎狀態(tài)下，ESC組WNT4蛋白相對水平（WNT4/

14、GAPDH，0.51±0.10）顯著低于NSC組（1.00±0.16），P＜0.05。ESC轉染pEGFP-N1-WNT4質粒組WNT4蛋白相對水平為0.94±0.11，顯著高于ESC組(P＜0.05)。ESC轉染pEGFP-N1-V質粒組WNT4蛋白相對水平為0.53±0.09，與ESC比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。pGCsi-WNT4-s1、pGCsi-WNT4-s2和pGCsi-WNT4-s3組WNT4蛋白相對水平分別為0

15、.51±0.10、0.61±0.11和0.60±0.12，與ESC組比較明顯降低(P＜0.05)。其中pGCsi-WNT4-s1組WNT4蛋白相對水平最低。NSC轉染pGCsi-V質粒組WNT4蛋白相對水平為1.05±0.17，與NSC組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　6、CCK-8細胞增殖實驗繪制細胞生長曲線顯示:基礎狀態(tài)下，ESC組在24h、48h、72h和96h各個時間點的相對增殖能力明顯高于NSC組相應各時間點

16、的增殖能力(P＜0.05)。上調ESC WNT4基因表達即ESC轉染pEGFP-N1-WNT4質粒后，ESC在48h、72h和96h各個時間點的相對增殖能力明顯降低，明顯低于ESC組對應各時間點的增殖能力(P＜0.01)。ESC轉染空質粒組（pEGFP-N1-V）在24h、48h、72h和96h各個時間點的相對增殖能力與ESC組相應各個時間點增殖能力比較差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。使NSC WNT4基因沉默即轉染pGCsi-WNT

17、4-s1質粒后，48h、72h和96h各個時間點的細胞相對增殖能力明顯升高，與NSC組對應各時間點的增殖能力比較(P＜0.01)。NSC轉染空質粒組在24h、48h、72h和96h各個時間點的相對增殖能力與NSC組相應各個時間點增殖能力比較差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　結論:
　　1、WNT4基因在正常子宮內膜的增殖期和分泌期均有表達，內異癥異位病灶及在位內膜中WNT4表達水平明顯低于對照組子宮內膜，WNT4的異常