牽張應力對MC3T3-E1和人牙周膜細胞成骨分化的影響及相關信號通路調(diào)控作用研究.pdf

1、應力刺激是調(diào)節(jié)骨代謝、維持骨量和骨功能結(jié)構的重要因素之一。應力狀態(tài)下的牙周組織改建是口腔正畸臨床矯治的生物學基礎，在機械應力刺激下，通過對牙周膜細胞以及成骨細胞生物學功能的調(diào)節(jié)，最終實現(xiàn)正畸牙齒的移動，同時維持牙槽骨組織應力改建的平衡。目前盡管人們對成骨細胞及牙周膜細胞的力學生物反應進行了大量的研究，包括其增殖、分化，功能狀態(tài)、成骨或破骨相關細胞因子的表達，胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路等，但成骨細胞或牙周膜細胞對應力刺激的識別機制、信號轉(zhuǎn)導機制、生

2、物響應機制等還并不十分清楚，尤其是對其生物力學信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)機制以及不同信號通路之間相互作用及相互關系知之甚少。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignalregulatedkinase1/2，ERK1/2)信號通路和核因子κB(NuclearfactorkappaB,NF-κB)信號通路是細胞內(nèi)應力信號轉(zhuǎn)導過程中兩條重要的信號轉(zhuǎn)導通路，在成骨前體細胞及牙周膜細胞成骨分化過程中發(fā)揮著重要作用。因此本研究通過MC3T3-E

3、1成骨樣細胞以及人牙周膜細胞的體外培養(yǎng)，通過建立細胞體外牽張應力加載模型，觀察牽張應力對MC3T3-E1成骨樣細胞或人牙周膜細胞成骨分化及相關基因表達的影響，了解牽張應力對ERK1/2與NF-kB信號通路的影響及兩條通路之間的相互作用關系。
　　實驗一：牽張應力對MC3T3-E1細胞成骨分化及相關基因表達的影響
　　本研究通過MC3T3-E1成骨樣細胞體外培養(yǎng)，觀察不同大小牽張應力刺激后，堿性磷酸酶(alkalinephos

4、phatase,ALP)、I型膠原（COLⅠ）、骨保護素(osteocalcin,OCN)、白細胞介素-6等基因表達的變化，研究發(fā)現(xiàn)，在8％及12％細胞形變率的周期性牽張應力作用下，MC3T3-E1細胞堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性及骨保護素(osteocalcin,OCN)基因的表達明顯降低，而ALP是成骨細胞早期分化的標志，OCN是成骨細胞成熟的標志。結(jié)果表明，MC3T3-E1細胞在8％及12％細胞

5、形變率的周期性牽張應力作用24小時后抑制了其向成熟的成骨細胞分化的能力。同時研究發(fā)現(xiàn)，牽張應力作用24小時后，I型膠原（COLⅠ）、白細胞介素-6（IL-6）基因表達顯著增加。而COLⅠ是構成骨組織細胞外基質(zhì)主要成分之一，說明早期的應力刺激可以促進骨組織細胞外基質(zhì)的合成，是骨組織應力改建的物質(zhì)基礎。IL-6作為一種多功能細胞因子，參與了正畸牙齒移動過程中牙周組織的改建，并作為一種有效的破骨細胞活化因子，刺激破骨細胞的生成和骨吸收活動。<

6、br>　　實驗二：牽張應力介導ERK1/2與NF-kB信號通路對MC3T3-E1細胞成骨分化及相關基因表達的影響
　　通過分別給予ERK1/2信號通路和NF-kB信號通路的特異性抑制劑，在基因水平上了解牽張應力作用下ERK1/2信號通路和NF-kB信號通路對MC3T3-E1細胞成骨分化及相關基因表達的調(diào)控。本研究結(jié)果顯示，在12％牽張應力作用下，MC3T3-E1細胞ALP、COLⅠ、IL-6的表達受ERK1/2信號通路的調(diào)控，而O

7、CN基因表達的變化不受ERK1/2通路的影響。NF-kB信號通路抑制劑PDTH可顯著抑制機械牽應張力作用下MC3T3-E1細胞ALP活性的降低，同時抑制IL-6基因的表達，而COLⅠ、OCN基因表達的變化不受NF-kB信號通路的影響。
　　實驗三：牽張應力對MC3T3-E1細胞ERK1/2與NF-kB信號通路影響的研究
　　通過觀察牽張應力對MC3T3-E1成骨樣細胞應力信號轉(zhuǎn)導通路ERK1/2與NF-kB通路本身信號分子的

8、反應，研究牽張應力對MC3T3-E1細胞ERK1/2與NF-kB信號通路的影響及其相互作用關系。研究發(fā)現(xiàn)，當MC3T3-E1細胞受到12％細胞形變率的周期性牽張應力作用時，ERK1/2信號通路及NF-κB信號通路同時被激活，ERK1/2、IKK磷酸化水平顯著提高，NF-kB（p65）表達明顯增加，但阻斷NF-κB信號通路并不會影響ERK1/2信號通路的激活。相反當阻斷ERK1/2信號通路時NF-kB信號通路激活受抑制，說明ERK1/2位

9、于IKK的上游，ERK1/2可能對IKK的磷酸化起作用。實驗四：牽張應力對人牙周膜細胞成骨相關基因表達的影響
　　通過利用人骨再生基因表達譜芯片及RealtimeRT-PCR觀察12％形變率牽張應力對人牙周膜細胞成骨相關基因表達的影響，探討牽張應力對人牙周膜細胞成骨分化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)12％細胞形變率的周期性牽張應力抑制了其成骨分化能力，有21種相關基因表達明顯升高，主要包括細胞外基質(zhì)相關基因及與炎癥活動相關細胞因子基因等。實驗結(jié)