去分化來源表皮干細胞的誘導及應用研究.pdf

1、目的：1.通過建立表皮細胞去分化的三種體外模型，對比三種去分化來源的表皮干細胞(dedifferention epidermal stem cells，DESCs)和原始表皮干細胞(epidermal stem cells，ESCs)的細胞形態(tài)和免疫表型，從中篩選出高效率的去分化誘導方法；2.將DESCs移植入裸鼠(BALB/c mice)背部創(chuàng)面，觀察其對創(chuàng)面愈合的促進作用。
　　 方法：1.由人新鮮的包皮標本中分離獲得ESC

2、s，通過傳代培養(yǎng)獲得成熟的表皮細胞(epidermal cells，ECs)，倒置顯微鏡下觀察兩種細胞的形態(tài)、免疫組化檢測細胞表型、流式細胞儀檢測細胞周期及增殖指數(shù)。2.取同一包皮分離的ESCs，隨機均分為5組，將其中一組ESCs作為原始表皮干細胞進行凍存待檢測，其余4組進行培養(yǎng)傳代，獲得成熟的ECs。再分別以熱、雙氧水(H2O2)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)處理其中的3組ECs，并在處理后3d、7d、14d將3組去分化細胞與E

3、SCs和ECs兩對照組一起進行相關檢測：以倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)改變；細胞免疫組織化學觀察B1整合素、CK10、CK19等表型的變化；隨機選10個視野做B1整合素陽性細胞計數(shù)、統(tǒng)計學分析。3.建立裸鼠背部創(chuàng)面模型，麻醉下在每個裸鼠背部脊柱兩側(cè)制備2個直徑為6mm的圓形創(chuàng)面，直至深筋膜，共24個創(chuàng)面。將24個創(chuàng)面隨機分為DESCs、ESCs、ECs、生理鹽水(normal saline，NS)組等4組，每組6個創(chuàng)面。分別消化離心以DA

4、PI標記的DESCs、ESCs、ECs，加入適量NS使細胞懸液終濃度都為2×106個/ml。用1ml注射器分別將DESCs、ESCs、ECs和NS注射于相應創(chuàng)緣皮下及創(chuàng)面基底部，劑量為每個創(chuàng)面0.2ml.于術后0d、3d、7d統(tǒng)計創(chuàng)面面積進行統(tǒng)計學分析；在術后7d進行創(chuàng)面取材制片，熒光顯微鏡觀察標記DAPI的DESCs、ESCs、ECs在創(chuàng)面的分布情況；創(chuàng)面取材制片行HE染色對比創(chuàng)面的愈合情況。
　　 結果：1.新鮮分離的ESC

5、s小圓珠狀，核大，核漿比高，細胞貼壁生長后連接成片成鋪路石樣，免疫組化顯示其β1整合素、CK19表達呈陽性，CK10表達陰性；ECs則寬大扁平，形態(tài)不規(guī)則，核小，核漿比低，無法形成克隆，其CK10表達呈陽性，β1整合素、CK19表達陰性.ESCs處于增殖期(G2/M)的細胞比例要高于ECs.2.三種DESCs在3d、7d、14d的β1整合素陽性細胞數(shù)均高于ECs組(p<0.01)；應用bFGF處理獲得的DESCs在3d和7d的β1整合素

6、陽性細胞數(shù)要高于其它兩種處理組(p<0.01)；三種DESCs在14d時的β1整合素陽性細胞數(shù)無明顯差異(p>0.05)，和原始ESCs相比亦無明顯差異(p>0.05).3.創(chuàng)面愈合實驗中DESCs組和ESCs組在術后3d和7d的創(chuàng)面面積均小于ECs組和NS組(p<0.01)，DESCs組和ESCs組在術后3d和7d的創(chuàng)面面積則無明顯差異(p>0.05).熒光顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)術后7d用DAPI標記的DESCs和ESCs在皮膚和皮下組織內(nèi)皆