恒河猴表皮干細胞誘導分化為角膜上皮細胞的體內外研究.pdf

1、目的：在一定的誘導條件下，分別于體內外觀察猴表皮干細胞橫向分化為角膜上皮細胞的情況。探索體內外誘導恒河猴表皮干細胞分化為角膜上皮細胞的可能性及誘導分化條件，為構建組織工程角膜和治療嚴重眼表疾病提供新型的種子細胞。 方法：1.采用組織塊培養(yǎng)法和消化培養(yǎng)法分離培養(yǎng)恒河猴表皮細胞；用Ⅳ型膠原吸附法分選表皮干細胞；分選后的細胞采用免疫熒光組織化學、逆轉錄-多聚酶鏈反應(RT-PCR)、流式細胞儀檢測β1整合素、角蛋白15(CK15)、α

2、6整合素和CD71。 2.分別用Hoechst33342和5-溴-2脫氧尿嘧啶(BrdU)兩種方法標記表皮干細胞。比較兩種標記方法的優(yōu)缺點。 3.采用Transwell非接觸共培養(yǎng)系統(tǒng)，用角膜上皮細胞和角膜緣基質組織與表皮干細胞共培養(yǎng)10天，檢測誘導前后的表皮干細胞β1整合素、角蛋白15、角蛋白3/12(CK3/12)和角蛋白1/10(CK1/10)的變化，以正常角膜上皮細胞和未共培養(yǎng)的表皮干細胞為對照。分別采用免疫組織

3、化學染色和RT-PCR的方法鑒定。 4.制作恒河猴角膜上皮缺損模型，利用誘導分化3天并標記BrdU的表皮干細胞為種子細胞，“去上皮”羊膜為載體，進行自體體內移植。對側眼行單純羊膜移植。8周后取材，進行蘇木素-伊紅(HE)染色、免疫組織化學檢查BrdU、β1整合素、角蛋白15、角蛋白3/12和角蛋白1/10的表達。透射電鏡檢查術后植片的超微結構。 結果：1.用Ⅳ型膠原分選體外培養(yǎng)的表皮細胞，可獲取10％左右的表皮干細胞。經

4、細胞免疫組織化學、RT-PCR和流式細胞儀鑒定，表皮干細胞呈β1整合素、α6整合素和角蛋白15陽性，CD71陰性。 2.Hoechst33342和BrdU兩種標記方法對細胞均未顯示明顯的毒性。Hoechst33342的標記率最高(100％)，但隨時間延長熒光有衰減，并且熒光有擴散現象，不利于以后的移植實驗；BrdU標記細胞較穩(wěn)定，實驗期間細胞內BrdU無明顯減少，標記率較高。 3.共培養(yǎng)10天后，誘導分化后的表皮干細胞除

5、顯示自身的標記(Hoechst33342)外，通過免疫組織化學染色和RT-PCR的檢查，還發(fā)現β1整合素和角蛋白15表達水平較誘導前降低，但角蛋白3/12的表達則由誘導前的陰性轉為誘導后的陽性。 4.BrdU標記表皮干細胞羊膜植片行自體眼表移植后8周，眼表上皮化良好：熒光素不著染、角膜透明、新生血管少；組織切片AE5染色陽性，上皮和基底膜結合緊密，上面4～6層復層細胞，胞核BrdU陽性，與正常角膜有相似組織學結構，無結膜細胞侵入

6、；超微結構顯示細胞之間連接緊密，見橋粒結構，細胞與基底膜之間見半橋粒結構。 結論：1.通過組織塊培養(yǎng)法和消化培養(yǎng)法均可獲得表皮干細胞，Ⅳ型膠原吸附法分選表皮干細胞是一種簡單、易行而且有效的方法，分選后的干細胞比例接近85％； 2.用非接觸共培養(yǎng)系統(tǒng)，利用原代培養(yǎng)的角膜上皮細胞和角膜緣基質組織作為微環(huán)境，成功誘導表皮干細胞轉化為角膜上皮樣細胞，證明了表皮干細胞的可塑性。為利用表皮干細胞替代角膜緣干細胞，重建眼表及構建生物角