神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究姓名：折曉寧申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：癌細(xì)胞分子病理學(xué)指導(dǎo)教師：陳杰19990701體在IMR32細(xì)胞系中恢復(fù)表達(dá)之后，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系對NGF誘導(dǎo)分化的反應(yīng)，以及進(jìn)—步恢復(fù)高和低兩種親和性神經(jīng)生長因子受體同時(shí)表達(dá)后，雙重轉(zhuǎn)化細(xì)胞系對NGF誘導(dǎo)分化的反應(yīng)及適時(shí)撤藥后細(xì)胞的生存狀態(tài)。／f我們首先利用基因重組技術(shù)，構(gòu)建了表達(dá)高親和性神經(jīng)生長因子受體基＼、因trkA的逆轉(zhuǎn)錄病

2、毒載體，經(jīng)雙向包裝細(xì)胞系PA317包裝后，病毒上清感染I積一32細(xì)胞，經(jīng)篩選得到抗性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后，經(jīng)Southernblot，RTPCR及流式細(xì)胞分析術(shù)，證實(shí)有外源基因的整合與穩(wěn)定表達(dá)，轉(zhuǎn)化細(xì)胞經(jīng)NGF誘導(dǎo)出現(xiàn)了明顯的分化反應(yīng)，而未轉(zhuǎn)化的母系及空病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞系均未見分化反應(yīng)，同時(shí)作為平行對照的低親和性神經(jīng)生長因子受體轉(zhuǎn)化細(xì)胞系對NGF誘導(dǎo)僅有輕微的分化反應(yīng)；高親和性神經(jīng)生長因子受體轉(zhuǎn)化細(xì)胞系在出現(xiàn)明顯分化之后，撤去NGF，細(xì)胞繼續(xù)維

3、持分化狀態(tài)不再回到原來非分化的幼稚狀態(tài)，細(xì)胞惡性表型得到較為完全的逆轉(zhuǎn)；但未誘導(dǎo)分化的細(xì)胞則仍繼續(xù)增殖。進(jìn)而我們又構(gòu)建了與外源trkA表達(dá)載體篩選標(biāo)記不同的低親和性神經(jīng)生長因子基因的表達(dá)載體，并同時(shí)轉(zhuǎn)化IMR32細(xì)胞系，通過雙藥物篩選，獲得了雙抗性克隆，培養(yǎng)后，經(jīng)RTPCR及流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)，雙重轉(zhuǎn)化細(xì)胞中含有高和低兩種親和性神經(jīng)生長因子受體的表達(dá)，繼而進(jìn)行NGF誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)及撤藥后細(xì)胞生存狀態(tài)觀察并與分別轉(zhuǎn)有兩種神經(jīng)生長因子受體的單獨(dú)轉(zhuǎn)

4、化細(xì)胞系及母系進(jìn)行對照。結(jié)果表明，雙重轉(zhuǎn)化細(xì)胞系在NGF誘導(dǎo)下較trkA單轉(zhuǎn)細(xì)胞系更快出現(xiàn)神經(jīng)元樣分化，軸突生長數(shù)量更多，分化高峰時(shí)間較單轉(zhuǎn)細(xì)胞明顯提前，在轉(zhuǎn)化細(xì)胞明顯分化之后撤去NGF，雙重轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中NGF誘導(dǎo)分化的細(xì)胞在撤藥35天后大量凋亡，對NGF生存依賴性明顯上升，而trkA單轉(zhuǎn)細(xì)膨E／f4B后對NGF不產(chǎn)生生存依賴，撤去NGF之后仍然維持分化狀態(tài)，在有限的觀察期內(nèi)未見分化逆轉(zhuǎn)，也未見明顯的凋亡細(xì)胞產(chǎn)生，低親和性神經(jīng)生長因子受