神經生長因子誘導人神經母細胞瘤細胞分化的實驗研究.pdf

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學博士學位論文神經生長因子誘導人神經母細胞瘤細胞分化的實驗研究姓名：折曉寧申請學位級別：博士專業(yè)：癌細胞分子病理學指導教師：陳杰19990701體在IMR32細胞系中恢復表達之后，轉化細胞系對NGF誘導分化的反應，以及進—步恢復高和低兩種親和性神經生長因子受體同時表達后，雙重轉化細胞系對NGF誘導分化的反應及適時撤藥后細胞的生存狀態(tài)。／f我們首先利用基因重組技術，構建了表達高親和性神經生長因子受體基＼、因trkA的逆轉錄病

2、毒載體，經雙向包裝細胞系PA317包裝后，病毒上清感染I積一32細胞，經篩選得到抗性克隆，擴大培養(yǎng)后，經Southernblot，RTPCR及流式細胞分析術，證實有外源基因的整合與穩(wěn)定表達，轉化細胞經NGF誘導出現(xiàn)了明顯的分化反應，而未轉化的母系及空病毒轉化細胞系均未見分化反應，同時作為平行對照的低親和性神經生長因子受體轉化細胞系對NGF誘導僅有輕微的分化反應；高親和性神經生長因子受體轉化細胞系在出現(xiàn)明顯分化之后，撤去NGF，細胞繼續(xù)維

3、持分化狀態(tài)不再回到原來非分化的幼稚狀態(tài)，細胞惡性表型得到較為完全的逆轉；但未誘導分化的細胞則仍繼續(xù)增殖。進而我們又構建了與外源trkA表達載體篩選標記不同的低親和性神經生長因子基因的表達載體，并同時轉化IMR32細胞系，通過雙藥物篩選，獲得了雙抗性克隆，培養(yǎng)后，經RTPCR及流式細胞術證實，雙重轉化細胞中含有高和低兩種親和性神經生長因子受體的表達，繼而進行NGF誘導分化實驗及撤藥后細胞生存狀態(tài)觀察并與分別轉有兩種神經生長因子受體的單獨轉

4、化細胞系及母系進行對照。結果表明，雙重轉化細胞系在NGF誘導下較trkA單轉細胞系更快出現(xiàn)神經元樣分化，軸突生長數(shù)量更多，分化高峰時間較單轉細胞明顯提前，在轉化細胞明顯分化之后撤去NGF，雙重轉化細胞系中NGF誘導分化的細胞在撤藥35天后大量凋亡，對NGF生存依賴性明顯上升，而trkA單轉細膨E／f4B后對NGF不產生生存依賴，撤去NGF之后仍然維持分化狀態(tài)，在有限的觀察期內未見分化逆轉，也未見明顯的凋亡細胞產生，低親和性神經生長因子受