分子伴侶Grp78對肝細胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、[研究背景與目的]： 肝細胞癌(HCC)是世界上第五大常見腫瘤，每年死于HCC患者人數(shù)超過500，000例。近年來HCC的治療理念、策略、模式、技術乃至醫(yī)療組織結(jié)構都經(jīng)歷了重大演變。盡管多專科和多元化治療模式顯著改變了HCC的治療效果，但HCC治療仍然面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)。早期發(fā)生的門靜脈侵襲和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，是肝癌病人手術后復發(fā)率高，預后差的最重要原因之一．目前肝細胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機制還不很清楚，因此探索腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機制、尋找抑制腫

2、瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的有效靶點，一直是國內(nèi)外研究的熱點。 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Grp78)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成分泌的一種多功能蛋白質(zhì)，對于折疊，成熟、轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)到細胞外發(fā)揮重要的作用。許多研究表明在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中伴隨著Grp78表達和功能的改變。最近的研究揭示了Grp78在轉(zhuǎn)移腫瘤表面表達，并且增高的Grp78表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度密切相關，這表明Grp78在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。 本研究旨在應用免疫組織化學方

3、法在人肝細胞癌組織中檢測Grp78，F(xiàn)AK的表達，并應用小干擾RNA(siRNA)技術特異性下調(diào)Grp78在肝癌細胞株BEL7402中的表達，探討Grp78在肝細胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用及分子機制。 [實驗方法]： 一、肝癌組織中Gap78和FAK表達的相關性研究應用免疫組織化學方法檢測44例人肝細胞癌手術切除組織中Grp78，F(xiàn)AK的表達及tyr397的磷酸化情況。每個組織標本取3張切片，每張切片隨機選取10個高倍視野進

4、行觀察、評分，統(tǒng)計學分析。 二、特異性下調(diào)Grp78對肝細胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移的影響通過siRNA技術特異性下調(diào)人肝細胞癌細胞株BEL7402中Grp78的表達，應用Transwell法和劃痕法對肝細胞癌侵襲，轉(zhuǎn)移能力的改變進行分析；應用免疫沉淀技術和GST-pulldown技術分別對FAK的磷酸化水平和小GTPase RhoA的活性進行研究；應用免疫印跡技術檢測E-鈣黏素，N-鈣黏素和波形蛋白(Vimentin)的表達。 三

5、、特異性下調(diào)Grp78抑制肝細胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制通過siRNA技術特異性下調(diào)人肝細胞癌細胞株BEL7402中Grp78的表達，應用細胞黏附實驗和細胞伸展實驗觀察特異性下調(diào)Grp78對細胞黏附特性和細胞極性形成的影響；應用明膠酶譜實驗檢測基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的活性；用免疫印跡實驗檢測細胞外基質(zhì)重構相關蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶-2，9(MMP-2，9)的表達以及轉(zhuǎn)錄因子c-jun的表達及磷酸化狀態(tài)． [實驗結(jié)果]： 一

6、、肝癌組織中Grp78和FAK表達的相關性研究應用免疫組織化學方法檢測44例人肝細胞癌組織中Grp78、FAK的表達情況，結(jié)果顯示Grp78、FAK表達與肝癌細胞的分化程度呈負相關(r=0.456，P=0.001；r=0.312，P=0.039)。研究結(jié)果還顯示在44例肝細胞癌中Grp78和FAK呈正相關(r=0.434，p=0.001)。 anti-FAK-p-tyr397抗體免疫組織化學方法檢測人肝細胞癌中FAK的活性，結(jié)

7、果表明FAK-p-tyr397染色強度與腫瘤細胞的分化程度不相關，Grp78的表達和磷酸化FAK不相關。 二、特異性下調(diào)Grp78對肝細胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移的影響Transwell實驗顯示Grp78-siRNA轉(zhuǎn)染細胞每個低倍視野細胞數(shù)平均為83個，明顯低于未轉(zhuǎn)染細胞(平均210個胝倍視野)和非特異性siRNA轉(zhuǎn)染細胞(平均220個/低倍視野)，統(tǒng)計學分析表明具有顯著性差異(P＜0.05)．這表明特異性下調(diào)Grp78可以抑制肝細胞癌的

8、侵襲。 劃痕法實驗結(jié)果顯示，24h后Grp78-siRNA轉(zhuǎn)染細胞的創(chuàng)口愈合較慢(53％)，而未轉(zhuǎn)染細胞(92％)和非特異性siRNA轉(zhuǎn)染細胞(94％)創(chuàng)口基本愈合。統(tǒng)計學分析表明具有顯著差異(p＜0.05)． 免疫沉淀實驗結(jié)果表明，在Crp78-siRNA轉(zhuǎn)染細胞中FAK的磷酸化水平明顯低于未轉(zhuǎn)染細胞和非特異性轉(zhuǎn)染細胞，統(tǒng)計學分析具有顯著差異(p＜0.05)；免疫印跡實驗結(jié)果表明在Grp78-siRNA轉(zhuǎn)染細胞、未轉(zhuǎn)染

9、細胞和非特異性轉(zhuǎn)染細胞中，F(xiàn)AK的表達沒有差異(p＞0.05)．以上結(jié)果表明特異性下調(diào)Grp78表達可以抑制FAK的磷酸化。 GST pull-down實驗結(jié)果顯示在Grp78-siRNA轉(zhuǎn)染細胞中，RhoA-GTP(活性形式)的水平明顯高于未轉(zhuǎn)染細胞和非特異性轉(zhuǎn)染細胞，統(tǒng)計學分析差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，這表明特異性下調(diào)Grp78可以促進RhoA的活化；免疫印跡實驗結(jié)果表明，在Grp78-siRNA轉(zhuǎn)染細胞、未轉(zhuǎn)染細胞

10、和非特異性轉(zhuǎn)染細胞中，RhoA的表達水平?jīng)]有顯著差異。 免疫印跡實驗結(jié)果表明，在Grp78-siRNA轉(zhuǎn)染細胞中N-鈣黏素、波形蛋白的表達明顯低于未轉(zhuǎn)染細胞和非特異性轉(zhuǎn)染細胞，而E-鈣黏素的表達明顯高于未轉(zhuǎn)染細胞和非特異性轉(zhuǎn)染細胞，經(jīng)統(tǒng)計學分析有顯著性差異(p＜0.05)。 三、特異性下調(diào)Grp78抑制肝細胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制應用細胞伸展實驗對Grp78-siRNA轉(zhuǎn)染細胞的極性形成進行研究，結(jié)果表明在不同時間點Gr

11、p78-siRNA轉(zhuǎn)染細胞的伸展明顯落后于非特異性RNA轉(zhuǎn)染細胞和未轉(zhuǎn)染細胞(p＜0.05)． 應用明膠酶譜技術和免疫印跡技術對Grp78-siRNA轉(zhuǎn)染細胞中MMP-2、MMP-9的表達與活性進行檢測，明膠酶譜的實驗結(jié)果顯示Grp78-siRNA轉(zhuǎn)染細胞MMP-2、MMP-9的活性明顯低于非特異性轉(zhuǎn)染細胞和未轉(zhuǎn)染細胞；免疫印跡實驗結(jié)果表明Grp78-siRNA轉(zhuǎn)染細胞中MMP-2、MMP-9的表達明顯低于非特異性轉(zhuǎn)染細胞和未轉(zhuǎn)

12、染細胞。 應用免疫印跡技術檢測轉(zhuǎn)錄因子c-jun的表達及磷酸化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Grp78-siRNA轉(zhuǎn)染細胞中，c-jun的磷酸化水平明顯降低，而c-jun的表達沒有變化。 [實驗結(jié)論]： 1.在人肝細胞癌組織中Grp78和FAK的表達與肝細胞癌的分化程度呈負相關；FAK-p-tyr397的表達與肝細胞癌的分化程度不相關； 2.Grp78在肝細胞癌組織中的表達與FAK的表達呈正相關； 3.特異性下