IntegrinαⅤ在結腸癌群集耐藥中作用及機制的研究.pdf

1、目的：研究integrinαV在結腸癌群集耐藥中的作用及其作用機制。 材料與方法：采用人結腸高分化腺癌細胞株HT29與LIM1863為研究對象，瓊脂糖抑制細胞貼壁、間斷水平回旋振蕩方法建立HT29多細胞球模型。加入梯度濃度奧沙利鉑作用2天，Cellcountingkit-8檢測細胞對奧沙利鉑的藥物敏感性。PCR擴增質粒pEGFP-N2的EGFP與CMV，并將其插入pSUPER.neo，構建pSUPER.neo.EGFP。合成分別

2、針對integrinαV、NFkappaB、JNK1、JNK2干擾的特異性DNA，并將其插入pSUPER.neo.EGFPR的H1啟動子下游HindⅢ、BglⅡ之間，而后用EeoRⅠ、XhoⅠ將H1啟動子、特異性干擾片段、CMV及EGFP-并酶切下來，插入逆轉錄病毒pLXSN，從而構建成功可特異干擾integrinαV、NFkappaB、JNK1、JNK2表達的逆轉錄病毒質粒。分別將逆轉錄病毒質粒轉染到HT29與LIM1863，G418

3、篩選，并連續(xù)多次挑選單克隆，從而得到穩(wěn)定表達逆轉錄病毒的，integrinαV、NFkappaB、JNK1、JNK2分別被特異性沉默的HT29細胞株(HT29/IntegrinαV-、HT29/NFkappaB-、HT29/JNK1-、HT29/JNK2-)與LIM1863細胞(LIMl863/IntegrinaV-；LIM1863/NFkappaB-、LIM1863/JNK1-、LIM1863/JNK2-)。將細胞分組，以奧沙利鉑30

4、0μg/L處理1小時作為化療組的干預因素。SDS上樣緩沖液裂解細胞得到全細胞蛋白，Bio-Rad公司RCDCProteinAssay檢測蛋白濃度，WesternBlot檢測蛋白的表達量。Pierce公司NE-PER（）NuclearandCytoplasmicExtractionReagents提取核蛋白，Bradford比色法檢測核蛋白濃度。Pierce公司LightShiftChemiluminescentEMSAKit化學發(fā)光法E

5、MSA檢測核蛋白NFkappaB活性。為排除空載體對實驗結果的干擾，相同方法檢測了空載體轉染細胞后的各項指標。分別取對數生長期的HT29細胞與HT29/IntegrinαV-、HT29/NFkappaB-、HT29/JNK1-、HT29/JNK2-細胞按2×107/只接種于6周齡雌性BALB/cnu/nu裸鼠前腋皮下，48小時后，按10mg/kg體重給予奧沙利鉑處理。觀察30天后處死，瘤體稱重。單因素方差分析統(tǒng)計分析數據。 結果

6、： 一、成功建立HT29多細胞球培養(yǎng)模型。 1、倒置顯微鏡下可見細胞聚集成團；掃描電鏡見多細胞球細胞黏附緊密，表面凹凸不平；HE染色顯示多細胞球由多層細胞組成，隨細胞球體積增大，中心出現壞死區(qū)。 2、HE染色顯示，隨著時間的延長，多細胞球內HT29細胞出現分化。細胞排列有序，形成腺管、腺腔樣結構；與LIM1863形成的腺腔、腺管相同。 3、透射電鏡下，HT29多細胞球及LIM1863都表現為細胞相互黏附；

7、細胞連接常見，特別是緊密連接，而單層細胞則未見細胞連接；線粒體及內質網發(fā)達；微絨毛長而豐富。 二、HT29多細胞球表現出腫瘤群集耐藥性。 HT29多細胞球對奧沙利鉑的藥物敏感性顯著下降。HT29多細胞球在奧沙利鉑濃度為50μg/L、500μg/L時的生存分數(x±s)分別為0.865±0.047、0.429±0.040；HT29單層細胞則分別為0.582±0.033、0.0930±0.020；二者有顯著性差異(p＜0.0

8、5)。LIM1863在奧沙利鉑濃度為50μg/L時的生存分數(x±s)為0.738±0.038。 三、RNA干擾integrinαV，能有效、顯著性地逆轉HT29多細胞球與LIM1863對奧沙利鉑的群集耐藥性。 1、利用逆轉錄病毒質粒介導的RNA干擾integrinαV后，Western Blot檢測示integrinαV表達明顯降低。 2、WesternBlot檢測結果示，RNA干擾integrinαV后，HT2

9、9多細胞球的磷酸化NFkappaB表達顯著下降；磷酸化JNK2表達顯著升高。 3、NFkappaB的EMSA結果顯示，沉默integrinαV后，HT29多細胞球的NFkappaB活性顯著下降。 4、RNA干擾integrinαV后，HT29多細胞球在奧沙利鉑濃度為500μg/L時的生存分數降低為0.300±0.037(p＜0.05)；而LIM1863在奧沙利鉑濃度為50μg/L時的生存分數降低為0.638±0.0296

10、0＜0.05)。 5、裸鼠皮下種植瘤結果顯示，RNA干擾integrinαV的HT29對奧沙利鉑的藥物敏感性顯著高于HT29奧沙利鉑化療組，二者的腫瘤平均重量(x±s)分別為(單位：g。下同。)，0.94±0.34，0.71±0.36(p＜0.05)。 四、RNA干擾NFkappaB，顯著性地逆轉HT29多細胞球與LIM1863對奧沙利鉑的群集耐藥性。 1、利用逆轉錄病毒質粒介導的RNAi沉默NFkappaB后，

11、WestemBlot檢測示NFkappaB表達明顯降低，EMSA顯示NFkappaB活性也被抑制。 2、WestemBlot檢測結果示，化療后，HT29多細胞球的磷酸化NFkappaB表達顯著升高；EMSA結果顯示的NFkappaB活性變化趨勢與WesternBlot相同。 3、RNA干擾NFkappaB后，HT29多細胞球的磷酸化JNK2表達顯著升高。 4、RNA干擾NFkappaB后，HT29多細胞球對奧沙利

12、鉑藥物敏感性的變化趨勢與RNA干擾integrinαV相同。在奧沙利鉑濃度為500μg/L時，HT29多細胞球的生存分數降低為0.346±0.038(p＜0.05)；而LIM1863在奧沙利鉑濃度為500g/mL下的生存分數降低為0.668±0.037(p＜0.05)。 5、HT29/NFkappaB一種植瘤在奧沙利鉑化療后，平均瘤重下降為0.76+0.43(p＜0.05)。 五、RNA干擾JNK1基因，HT29單層細胞

13、、HT29多細胞球與LIM1863對奧沙利鉑的藥物敏感性無顯著性改變，雖然逆轉錄病毒質粒介導的RNAi能有效降低其表達。 六、RNA干擾JNK2基因，顯著增加了HT29多細胞球與LIM1863對奧沙利鉑的群集耐藥性。 1、利用逆轉錄病毒質粒介導的RNAi沉默K2后，WesternBlot檢測示，JNK2表達明顯降低，磷酸化JNK2表達也被有效抑制。 2、RNA干擾JNK2后，HT29多細胞球在奧沙利鉑濃度為500

14、μg/L時的生存分數升高為0.493±0.032(p＜0.05)；而LIM1863在奧沙利鉑濃度為50g/mL下的生存分數升高為0.798±0.038(p＜0.05)。 3、HT29/JNK2-裸鼠皮下種植瘤結果與多細胞球結果趨勢一致。瘤重升高為1.10±0.46(p＜0.05)。 結論： 1、HT29多細胞球能較好地模擬體內尚未形成血管的微小實體瘤，為缺氧、細胞間黏附、細胞連接以及分化等研究提供了較好的細胞模型

15、。 2、建立了一套可以有效進行RNAi的普通質粒.逆轉錄病毒質粒系統(tǒng)，可穩(wěn)定地、有效地、特異性沉默目的基因。 3、細胞黏附分子integrinαV的激活是結腸癌群集耐藥產生的重要原因之一，其機制與激活NFkappaB從而抑制JNK2信號轉導通路相關。 4、干擾integrinαV的表達，或阻斷其激活NFkappaB、抑制JNK2的信號轉導通路可以有效地逆轉結腸癌群集耐藥。 5、沉默JNK1基因對結腸癌群集