凝血酶在腦出血后腦損傷和腦康復過程中不同作用的機制研究.pdf

1、自發(fā)性腦出血(ICH)是一種常見的中風亞型，發(fā)病后情況往往很嚴重，其死亡率高達40％以上，而且生還者往往有明顯的神經功能損傷。腦出血后腦損傷的機制很復雜，目前認為：1)初始的物理損傷以及血腫占位效應；2)凝血酶；3)血紅蛋白以及其降解產物；4)炎性介質與補體為四個比較明確的主要原因。蛋白激酶受體1(PAR1)是一種重要的凝血酶受體，與腦出血后的腦損傷密切相關。同時，凝血酶及其受體PAR1又被認為與腦出血后的腦康復有密切聯(lián)系。但這些目前都

2、還缺乏更加直接的證據(jù)和深刻的研究。
　　 本文通過動物實驗結合離體實驗的方法，進一步研究：1)細胞的自噬性死亡在凝血酶導致的腦損傷過程中是否存在和相關作用；2)應用基因敲除技術得到的動物模型，獲得PAR1在凝血酶導致腦損傷過程中作用的直接證據(jù)；3)探討凝血酶及其受體PAR1在腦損傷后的腦康復，特別是對腦血管再生的作用。期望通過上述的研究，進一步闡明凝血酶及其受體PAR1在腦出血后的各種不同作用，為臨床治療的策略提供充分的理論和循

3、證醫(yī)學證據(jù)。
　　 第一部分凝血酶在腦出血后細胞自噬性死亡過程中的作用
　　 目的：研究凝血酶在腦出血后細胞自噬性死亡過程中的作用。方法：本實驗分成兩部分。第一部分為動物實驗，采用立體定向腦內注射自體血的方法制作大鼠腦出血模型，干預組大鼠自體血中同時加入凝血酶抑制劑水蛭素，于制作模型后7天處死大鼠；立體定向腦內注射凝血酶制作大鼠凝血酶腦損傷模型，于制作模型后1天，3天和7天處死大鼠,用免疫組織化學染色和免疫Western

4、 Bolt法檢測自噬相關指標的變化，用電鏡直接觀察自噬細胞的存在和分布。第二部分為離體實驗，大鼠原代培養(yǎng)星形細胞在凝血酶以及對照的生理鹽水處理后，結合自噬抑制劑3-MA的應用，采取細胞免疫化學染色和免疫Western Blot法檢測細胞自噬的變化，并同時應用LDH檢測觀察細胞總體的死亡程度。結果：第一部分的動物實驗，大鼠腦出血后，注射側基底節(jié)的自噬相關指標：LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉變，cathepsin D和beclin-1的表達均有

5、明顯升高，水蛭素可以抑制上述自噬相關指標的上調。在大鼠凝血酶注射模型中，術側基底節(jié)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉變，cathepsin D和beclin-1的表達也明顯升高，高峰在術后3天；電鏡下可以看到凝血酶處理后3天大鼠注射側基底節(jié)分布大量自噬細胞。第二部分離體實驗中，星形細胞凝血酶處理后24小時，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉變和beclin-1的表達明顯升高。MDC染色進一步證實，大鼠星形細胞在凝血酶處理后自噬程度顯著增加，24小時達高峰。

6、自噬抑制劑3-MA可以抑制凝血酶激活的細胞自噬，但加重了細胞總體的死亡。
　　 第二部分 PAR1在凝血酶導致腦損傷過程中的作用
　　 目的：研究PAR1在凝血酶導致腦損傷過程中所起的作用。方法：應用PAR1基因敲除(PAR1-/-)和PAR1基因部分敲除(PAR1+/-)的小鼠，和野生型(wildtype，WT)小鼠進行比較。本實驗分成兩部分。第一部分為動物實驗，WT，PAR1+/-和PAR1-/-小鼠立體定向下腦內注

7、射凝血酶，于制作模型后1天進行行為學評估，并分別于術后1天和3天處死，分別用Fluoro-Jade C，PANT和TUNEL染色法檢測細胞死亡，用免疫Western Blot法檢測腦組織內P44/42 MAPK和bc12的蛋白水平。第二部分為離體實驗，WT和PAR1-/-小鼠的神經細胞經凝血酶(5或10U/ml)處理后，提取上清液行LDH檢測。結果：動物實驗中，PAR1-/-小鼠在行為學檢查中的表現(xiàn)好于WT小鼠，術后3天的死亡率也低于W

8、T和PAR1+/-小鼠。PAR1-/-小鼠術后1和3天注射側基底節(jié)Fluoro-Jade C，PANT和TUNEL染色，陽性細胞數(shù)均明顯少于對照WT小鼠。PAR1+/-小鼠術后1天注射側基底節(jié)Fluoro-Jade C染色陽性細胞數(shù)也少于對照WT小鼠。免疫Western Blot法檢測，PAR1-/-小鼠術后1天注射側基底節(jié)的p-P44/42 MAPK水平明顯高于WT和PAR1+/-小鼠，PAR1-/-和PAR1+/-小鼠術后3天注射側

9、基底節(jié)的bcl2水平顯著低于WT小鼠。離體實驗中，經凝血酶處理后的PAR1-/-小鼠神經細胞，上清液中LDH的含量明顯低于WT小鼠神經細胞。
　　 第三部分凝血酶促進星形細胞分泌VEGF
　　 目的：研究小劑量凝血酶在腦損傷后腦康復的過程中，促進腦血管再生的作用以及相關機制。方法：本實驗分成兩部分：第一部分，大鼠星形細胞分別應用生理鹽水，凝血酶，凝血酶受體PAR1激動劑TRAG，細胞外信號調節(jié)激酶(P44/42 MAPK

10、)抑制劑PD98059以及缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)抑制劑YC-1處理，提取上清液行血管內皮生長因子(VEGF)的ElISA檢測，剩余細胞行免疫化學染色，免疫Western Blot以及HIF-1α的ELISA檢測。第二部分應用了WT和PAR1-/-小鼠的星形細胞，處理和檢測同第一部分。結果：第一部分中，凝血酶和TRAG均可上調星型細胞中VEGF和p-P44/42 MAPK的蛋白水平，PD98059可以阻斷該上調作用，YC-1則

11、沒有這種抑制作用。第二部分，PAR1-/-小鼠星形細胞中，凝血酶處理后VEGF和p-P44/42 MAPK上調的程度比較WT小鼠明顯低，HIF-1α蛋白水平在經相同處理的兩種小鼠星形細胞中未見明顯差異。
　　 結論:本實驗應用動物實驗和離體實驗兩種辦法，研究凝血酶在腦出血后腦損傷和腦康復過程中的不同作用，結果表明：
　　 1.凝血酶在腦出血后細胞自噬性死亡的過程中有重要的作用。自噬在凝血酶導致的星形細胞死亡中有細胞保護的

12、作用。
　　 2.凝血酶引起的腦損傷在PAR1-/-小鼠中程度較輕，其機制可能和P44/42MAPK通路相關。
　　 3.小劑量凝血酶上調星形細胞中VEGF的水平，該作用通過PAR1和P44/42 MAPK通路調節(jié)，但與HIF-1α的相關性不明確。
　　 凝血酶及其受體PAR1在腦出血后腦損傷和腦康復的過程中有著復雜和重要的作用。進一步的明確凝血酶在各項病理過程中的影響以及相關機制，有助于更加準確與合理的藥物控制