人類UHRF1基因腫瘤生物學功能的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:研究hUHRF1基因表達水平改變對乳癌細胞生長、增殖、侵襲、轉移以及放射治療敏感性的影響,及其生物學功能的作用機制,為研究乳癌的發(fā)生、發(fā)展和治療提供了新的研究方向和理論基礎,為將來hUHRF1基因在腫瘤臨床治療應用提供理論基礎和實驗依據。 方法: ①采用Western Blot法,檢測多種人腫瘤細胞和正常細胞中hUHRF1的蛋白表達情況;Northern Blot法對臨床乳癌組織樣本和正常乳腺組織中hUHRF1的R

2、NA表達水平進行檢測; ②根據GeneBank中hUHRF1的基因序列,自行設計擴增hUHRF1基因全長cDNA的引物一對,構建hUHRF1的真核表達載體和腺病毒表達載體; ③采用陽離子脂質體Lipofactamin2000介導的方法,進行hUHRF1基因轉染,在含G418的培養(yǎng)基中篩選陽性克隆,采用RT—PCR和Western Blot法檢測陽性克隆中hUHRF1的RNA和蛋白表達水平; ④采用MTT法觀察hU

3、HRF1基因轉染,對體外培養(yǎng)的不同p53基因表型、不同組織來源的乳癌細胞生長、增殖的影響;皮下瘤液接種法,制備乳癌動物模型,觀察hUHRF1基因在體內對乳癌生長的影響; ⑤細胞接受不同劑量的X射線、UV輻照和γ射線照射后的克隆形成實驗,觀察細胞輻射敏感性的變化; ⑥劃痕實驗和Boyden小室法,觀察細胞侵襲、轉移能力的變化; ⑦流式細胞術分析細胞周期進程和細胞凋亡變化;免疫組化法觀察動物腫瘤組織中新生血管的形成;

4、染色體畸變分析觀察基因組穩(wěn)定性變化;Western Blot法檢測調控細胞周期、凋亡、DNA損傷修復相關蛋白、細胞侵襲、轉移相關基因的蛋白表達水平變化。 結果: ①腫瘤細胞中hUHRF1的蛋白表達水平明顯高于正常細胞;臨床乳癌組織中hUHRF1的RNA水平較正常乳腺組織的表達水平高; ②構建的hUHRF1真核表達載體,經過限制性核酸內切酶BamHⅠ和XhoⅠ酶切后電泳和擴增片斷測序,證實載體構建成功; ③

5、G418篩選得到的陽性克隆,經RT—PCR和Western Blot證實,hUHRF1基因在乳癌細胞中高表達,表明高hUHRF1表達的細胞株篩選成功; ④MTT的結果表明:hUHRF1可以促進p53突變型乳癌細胞MDA—MB—231和BT—549的生長,而對p53野生型乳癌細胞MCF—7的生長未見明顯影響;而且,hUHRF1的高水平表達,可以通過誘導腫瘤血管形成,在體內促進乳癌細胞的生長; ⑤流式細胞術分析結果表明:hU

6、HRF1基因轉染后,p53突變型乳癌細胞MDA—MB—231的細胞周期進程中,G0/G1比例由69.157%降至49.854%,subG1%由16.31%降至9.32%,差異有統計意義;而p53野生型乳癌細胞MCF—7的細胞周期進程的G0/G1比例由73.874%降至72.812%,subG1%由14.88%降至8.08%,差異沒有統計意義,即外源性hUHRF1的高表達,可明顯縮短p53突變型乳癌細胞MDA—MB—231的細胞周期G0/

7、G1期進程,抑制細胞凋亡的發(fā)生,而對p53野生型乳癌細胞MCF—7的生長未產生明顯影響。Western Blot法檢測細胞周期G1期調控因子cyclinD1和凋亡相關因子Bax在MDA—MB—231細胞中的表達,結果表明,hUHRF1基因轉染可誘導cyclinD1的表達水平增強,而抑制促凋亡蛋白Bax的表達,與我們流式細胞術的分析結果一致; ⑥集落形成實驗的結果顯示,hUHRF1高水平表達可以降低乳癌細胞MDA—MB—231對X

8、射線、UV輻照,HeLa細胞對γ射線的輻射敏感性;采用siRNA,“敲除”hUHRF1基因,可增加乳癌細胞MDA—MB—231的輻射敏感性; ⑦hUHRF1的高水平表達,可以誘導輻射后的細胞發(fā)生明顯的G2期阻滯;抑制細胞凋亡;抑制輻照后盼細胞中cyclinB1和Bax的表達,而Bcl—2的表達水平影響不明顯。 ⑧Western Blot法檢測DNA損傷修復過程中的調節(jié)因素XRCC4,Ku70,Ku80蛋白表達水平變化,結

9、果顯示:在相同劑量的X射線照射下,hUHRF1基因的高表達,可以誘導乳癌細胞MDA—MB—231中Ku70,Ku80的表達增強;染色體的畸變率降低;但在腺病毒感染的HeLa細胞中,Ad5—hUHRF1僅使XRCC4的表達水平增加,采用siRNA“敲除”HeLa細胞中XRCC4的表達,改變了hUHRF1調節(jié)的輻射敏感性。 ⑨劃痕實驗和Boyden小室法的結果顯示:hUHRF1高水平表達,可以增強乳癌細胞MDA—MB—231的侵襲和

10、轉移能力;但是,Western Blot法檢測結果發(fā)現,hUHRF1基因高水平表達并不改變PTEN和maspin的表達水平,但是降低細胞的PTEN和maspin表達水平則影響了hUHRF1對細胞的侵襲和轉移能力。 結論: ①hUHRF1基因高表達,在體外通過縮短細胞周期進程,抑制細胞凋亡,促進p53突變型乳癌細胞的生長,而對p53野生型乳癌細胞的生長無明顯影響。 ②提高hUHRF1基因表達,通過促進腫瘤血管形成,

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