人類UHRF1基因腫瘤生物學功能的研究.pdf

1、目的：研究hUHRF1基因表達水平改變對乳癌細胞生長、增殖、侵襲、轉移以及放射治療敏感性的影響，及其生物學功能的作用機制，為研究乳癌的發(fā)生、發(fā)展和治療提供了新的研究方向和理論基礎，為將來hUHRF1基因在腫瘤臨床治療應用提供理論基礎和實驗依據。 方法： ①采用Western Blot法，檢測多種人腫瘤細胞和正常細胞中hUHRF1的蛋白表達情況；Northern Blot法對臨床乳癌組織樣本和正常乳腺組織中hUHRF1的R

2、NA表達水平進行檢測； ②根據GeneBank中hUHRF1的基因序列，自行設計擴增hUHRF1基因全長cDNA的引物一對，構建hUHRF1的真核表達載體和腺病毒表達載體； ③采用陽離子脂質體Lipofactamin2000介導的方法，進行hUHRF1基因轉染，在含G418的培養(yǎng)基中篩選陽性克隆，采用RT—PCR和Western Blot法檢測陽性克隆中hUHRF1的RNA和蛋白表達水平； ④采用MTT法觀察hU

3、HRF1基因轉染，對體外培養(yǎng)的不同p53基因表型、不同組織來源的乳癌細胞生長、增殖的影響；皮下瘤液接種法，制備乳癌動物模型，觀察hUHRF1基因在體內對乳癌生長的影響； ⑤細胞接受不同劑量的X射線、UV輻照和γ射線照射后的克隆形成實驗，觀察細胞輻射敏感性的變化； ⑥劃痕實驗和Boyden小室法，觀察細胞侵襲、轉移能力的變化； ⑦流式細胞術分析細胞周期進程和細胞凋亡變化；免疫組化法觀察動物腫瘤組織中新生血管的形成；

4、染色體畸變分析觀察基因組穩(wěn)定性變化；Western Blot法檢測調控細胞周期、凋亡、DNA損傷修復相關蛋白、細胞侵襲、轉移相關基因的蛋白表達水平變化。 結果： ①腫瘤細胞中hUHRF1的蛋白表達水平明顯高于正常細胞；臨床乳癌組織中hUHRF1的RNA水平較正常乳腺組織的表達水平高； ②構建的hUHRF1真核表達載體，經過限制性核酸內切酶BamHⅠ和XhoⅠ酶切后電泳和擴增片斷測序，證實載體構建成功； ③

5、G418篩選得到的陽性克隆，經RT—PCR和Western Blot證實，hUHRF1基因在乳癌細胞中高表達，表明高hUHRF1表達的細胞株篩選成功； ④MTT的結果表明：hUHRF1可以促進p53突變型乳癌細胞MDA—MB—231和BT—549的生長，而對p53野生型乳癌細胞MCF—7的生長未見明顯影響；而且，hUHRF1的高水平表達，可以通過誘導腫瘤血管形成，在體內促進乳癌細胞的生長； ⑤流式細胞術分析結果表明：hU

6、HRF1基因轉染后，p53突變型乳癌細胞MDA—MB—231的細胞周期進程中，G0/G1比例由69．157%降至49．854%，subG1%由16．31%降至9．32%，差異有統計意義；而p53野生型乳癌細胞MCF—7的細胞周期進程的G0/G1比例由73．874%降至72．812%，subG1%由14．88%降至8．08%，差異沒有統計意義，即外源性hUHRF1的高表達，可明顯縮短p53突變型乳癌細胞MDA—MB—231的細胞周期G0/

7、G1期進程，抑制細胞凋亡的發(fā)生，而對p53野生型乳癌細胞MCF—7的生長未產生明顯影響。Western Blot法檢測細胞周期G1期調控因子cyclinD1和凋亡相關因子Bax在MDA—MB—231細胞中的表達，結果表明，hUHRF1基因轉染可誘導cyclinD1的表達水平增強，而抑制促凋亡蛋白Bax的表達，與我們流式細胞術的分析結果一致； ⑥集落形成實驗的結果顯示，hUHRF1高水平表達可以降低乳癌細胞MDA—MB—231對X

8、射線、UV輻照，HeLa細胞對γ射線的輻射敏感性；采用siRNA，“敲除”hUHRF1基因，可增加乳癌細胞MDA—MB—231的輻射敏感性； ⑦hUHRF1的高水平表達，可以誘導輻射后的細胞發(fā)生明顯的G2期阻滯；抑制細胞凋亡；抑制輻照后盼細胞中cyclinB1和Bax的表達，而Bcl—2的表達水平影響不明顯。 ⑧Western Blot法檢測DNA損傷修復過程中的調節(jié)因素XRCC4，Ku70，Ku80蛋白表達水平變化，結

9、果顯示：在相同劑量的X射線照射下，hUHRF1基因的高表達，可以誘導乳癌細胞MDA—MB—231中Ku70，Ku80的表達增強；染色體的畸變率降低；但在腺病毒感染的HeLa細胞中，Ad5—hUHRF1僅使XRCC4的表達水平增加，采用siRNA“敲除”HeLa細胞中XRCC4的表達，改變了hUHRF1調節(jié)的輻射敏感性。 ⑨劃痕實驗和Boyden小室法的結果顯示：hUHRF1高水平表達，可以增強乳癌細胞MDA—MB—231的侵襲和

10、轉移能力；但是，Western Blot法檢測結果發(fā)現，hUHRF1基因高水平表達并不改變PTEN和maspin的表達水平，但是降低細胞的PTEN和maspin表達水平則影響了hUHRF1對細胞的侵襲和轉移能力。 結論： ①hUHRF1基因高表達，在體外通過縮短細胞周期進程，抑制細胞凋亡，促進p53突變型乳癌細胞的生長，而對p53野生型乳癌細胞的生長無明顯影響。 ②提高hUHRF1基因表達，通過促進腫瘤血管形成，