UHRF1對腎癌細胞增殖和侵襲的影響及機制研究.pdf

1、背景：
　　腎癌在成人惡性腫瘤中占2％，是泌尿系腫瘤患者的第三大死亡原因。盡管目前的診斷技術已經比較先進，但是仍有30%左右的腎癌患者在確診時已發(fā)生轉移。晚期腎癌患者對放化療的敏感性差，治療效果不理想，免疫治療（如IL-2和IFN-α）也只對10%～20%的患者有效。因此，迫切需要尋找新的有效的治療靶點和治療策略。
　　UHRF1(Ubiquitin-like protein containing PHD and RING

2、finger domains1)是多功能核蛋白 UHRF家族的成員之一，具有多個結構域，包括一個泛素樣結構域、一個植物同源結構域（plant homeodomain，PHD）、一個SET和RING相關（SET and RING associated, SRA）結構域和一個環(huán)指（RING finger）結構域。UHRF1在多種腫瘤中呈高表達，并可通過特定結構域參與DNA甲基化修飾和組蛋白翻譯后修飾，從而調控基因表達，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研

3、究發(fā)現，UHRF1在腎癌組織中也呈高表達，且其表達水平與腎癌的病理分期和組織學分級密切相關。但是UHRF1在腎癌發(fā)生發(fā)展中的具體機制尚不清楚。因此我們擬探討UHRF1在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用及相關的分子機制，以期為尋找新的腎癌診斷指標和治療靶點提供理論基礎和實驗依據。
　　目的：
　　1．明確UHRF1在腎癌細胞增殖、凋亡及侵襲過程中的作用；
　　2．明確UHRF1調節(jié)腎癌細胞增殖、凋亡及侵襲的分子機制；
　　方法

4、：
　　1．設計并合成針對UHRF1的siRNA，轉染腎癌769-P和786-O細胞后利用Western blot和RT-PCR分別在蛋白水平和mRNA水平檢測UHRF1的表達情況，驗證siRNA的干擾效果。
　　2．用干擾效果良好的siRNA轉染769-P和786-O細胞后，用MTT檢測細胞增殖，并繪制細胞生長曲線，用流式細胞術檢測細胞凋亡，利用Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力，檢測UHRF1的表達下調對細胞增殖、

5、凋亡和侵襲的影響。
　　3．用已經證實干擾效果良好的表達shUHRF1的慢病毒和對照病毒感染769-P和786-O細胞后，接種于裸鼠皮下，每3天測量一次腫瘤長短徑，計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。
　　4．利用數字基因表達譜技術，比較shUHRF1表達下調的769-P細胞和對照細胞中的差異表達基因，得到可能受UHRF1調控的下游靶基因，通過RT-PCR對這些差異表達基因進行驗證，發(fā)現在UHRF1表達下調的細胞中腫瘤抑制基因T

6、XNIP的表達顯著上調。
　　5．用干擾效果良好的siRNA同時下調TXNIP和UHRF1，比較與單獨下調UHRF1的細胞在細胞增殖、凋亡及侵襲能力的差異。
　　6．針對TXNIP基因的啟動子區(qū)設計引物，利用抗UHRF1的抗體及對照抗體進行染色質免疫共沉淀（ChIP）實驗，檢測UHRF1是否直接結合于TXNIP基因的啟動子區(qū)，從而調控其表達。
　　結果：
　　1．在腎癌細胞769-P和786-O中下調UHRF1的

7、表達后，細胞凋亡明顯增加，細胞增殖及細胞侵襲能力明顯減弱。
　　2．UHRF1表達下調的769-P和786-O細胞在裸鼠體內的生長受到顯著抑制。
　　3．在腎癌細胞中下調UHRF1的表達后，腫瘤抑制基因TXNIP的表達水平明顯上調。
　　4．同時下調TXNIP和UHRF1的表達，可有效挽救單獨下調UHRF1所引起的增殖和侵襲抑制及凋亡，說明TXNIP是UHRF1的有效下游靶基因。
　　5．ChIP結果顯示UHRF