Disulfiram聯(lián)合Cu通過上調ROS-JNK,下調Nrf2以及NF-κB通路靶向殺傷AML干細胞.pdf

1、背景：急性髓細胞白血病(Acute Myeloid Leukemia, AML)是一種異質性疾病，隨著化療方案的改進，其緩解率不斷提高，但難治和復發(fā)仍然是阻礙AML治愈的主要難題。白血病干細胞(leukemia stem cells，LSC)是白血病的起源細胞，這一小群細胞能夠自我更新和分化，維持著白血病的發(fā)展，LSC大部分處于靜止期并表達異常的生存信號通路，這使得它們往往逃逸于主要針對快速增殖細胞的傳統(tǒng)化療藥物，成為AML難治復發(fā)的關

2、鍵，因此，在聯(lián)合化療的基礎上增加針對LSC而又對正常造血細胞無損傷的靶向藥物才是AML最有效、最根本的治療策略。雙硫侖(disulfiram，DS)是一種在臨床使用了60年的抗酗酒藥物，安全低毒且價格低廉。近年來研究發(fā)現(xiàn)DS具有廣譜的抗腫瘤活性，可以誘導多種腫瘤細胞凋亡并抑制其生長。Cu是生物有機體一種必需的微量金屬，許多關鍵的酶和轉錄因子需要Cu來發(fā)揮活性。DS具有轉運Cu離子到胞內的能力，添加外源CuCl2可以明顯增強DS殺傷腫瘤細

3、胞的能力。關于DS/Cu抗腫瘤作用的分子機制尚不明確，目前認為主要與其作為蛋白酶體抑制劑抑制NF-κB通路相關以及調節(jié)氧化應激反應有關。我們研究團隊前期也已經證明了DS/Cu能夠通過抑制NF-κB、激活ROS誘導急性淋巴細胞白血病Molt4細胞和淋巴瘤Raji細胞凋亡并抑制其增殖，且能逆轉急性髓系白血病細胞HL-60耐藥細胞株對多柔比星的耐藥。但DS/Cu是否具有殺傷LSC的作用及相關的機制仍不明確。核轉錄因子κB(Nuclear fa

4、ctor-κB，NF-κB)是一種作用廣泛的轉錄因子，是由兩種Rel家族蛋白構成的二聚體蛋白質。p65/p50二聚體是NF-κB中最重要的一種，廣泛存在于細胞漿中，可調控下游一系列抗凋亡基因的表達，被認為是調控NF-κB活性的關鍵成分。NF-κB的異常激活跟多種病理現(xiàn)象相關，它的下游靶基因產物也有促進細胞增殖、抑制細胞凋亡及促進癌基因蛋白表達的作用。多種腫瘤細胞中也觀察到NF-κB的異常激活，同時一些傳統(tǒng)化療藥物也可以激活NF-κB，使

5、之成為腫瘤耐藥的關鍵因素。近年研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB在LSC中持續(xù)激活而在正常造血干細胞中不激活，因此，靶向NF-κB相關的信號轉導不僅能選擇性殺傷LSC，還能增強傳統(tǒng)化療藥物的敏感性?；钚匝?Reactive Oxygen Species，ROS)是體內正常氧代謝的產物，生理劑量的ROS可以被體內的抗氧化物清除，但急劇增高的ROS可以致使脂質、蛋白質和DNA過氧化，致使細胞發(fā)生損傷。近年來發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中ROS產生較正常細胞明顯增多，即處

6、于一種更高的氧化應激狀態(tài)，這使得腫瘤細胞較正常細胞更易受外界氧化刺激的影響，同時，在持續(xù)的氧化刺激下，一些氧化還原敏感的轉錄因子（如NF-κB，Nrf2，c-jun, HIF-1）被激活，調節(jié)下游的抗氧化蛋白的表達增加，維持腫瘤細胞的氧化平衡，這些轉錄因子又可通過調節(jié)下游基因促進腫瘤細胞的增殖、生長、分化，使腫瘤細胞進一步獲得存活優(yōu)勢并產生耐藥性。ROS對于維持LSC生存也有重要作用，小白菊內酯及其類似物可以通過抑制NF-κB通路、促進

7、ROS蓄積誘導AML和急變期的CML的LSC細胞凋亡，而對正常的細胞無影響;最近有人發(fā)現(xiàn)LSC主要存在于ROS低水平(ROS-low)的AML細胞亞群中，并伴有高表達的BCL-2，使用BCL-2抑制劑ABT-263可以減弱氧化磷酸化，誘導ROS堆積，最終殺傷這群ROS-low的細胞，而對正常HSC無明顯影響，提示特殊的氧化還原調節(jié)機制也是LSC一個良好的治療靶點。Nrf2(nuclear factor-erythroid2-relate

8、d factor2)是氧化調節(jié)中重要的轉錄因子，它由ROS誘導激活，而其靶基因產物又可以保護細胞從而不受氧化應激的損傷。在多種腫瘤細胞中存在Nrf2的異常激活，同樣也成為引起腫瘤細胞耐藥的重要因素，近年來發(fā)現(xiàn)，AML細胞核中存在Nrf2的異常激活，從而保護AML細胞免受氧化損傷并產生耐藥性。c-jun N端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)家族是是MAPK（絲裂原激活的蛋白激酶）家族中重要的一員。JNK屬于酪

9、氨酸蛋白激酶途徑，可被不同形式的胞外刺激通過不同的信號通路活化。JNK/c-Jun通路與多種疾病發(fā)生機制有關，在AML的發(fā)生、發(fā)展及耐藥中也有重要作用，多種藥物可通過活化JNK通路引起白血病細胞的凋亡，而ROS能夠通過抑制JNK磷酸酶及使JNK潛在抑制分子失活等途徑使JNK得到持續(xù)的活化促進腫瘤細胞凋亡。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)Disulfiram(DS)單藥及DS聯(lián)合Cu離子(DS/Cu)可以通過抑制NF-κB，誘導ROS蓄積而誘導血液系腫

10、瘤細胞株凋亡和逆轉耐藥，因此本研究擬進一步探討DS/Cu對LSC的作用及相關的分子機制。
　　 目的：以CD34+CD38KG1a細胞做為LSC模型，并結合CD34+CD38-原代AML細胞和正常HSC，探討DS及DS/Cu在體外對LSC的靶向殺傷作用，并進一步從NF-κB通路、ROS以及JNK、Nrf2通路探討其潛在的分子機制。
　　 方法：①應用流式細胞分選術或磁珠分選術分選出人急性髓系白血病細胞株KG1a細胞和原代

11、AML細胞中具有LSC特性的CD34+CD38-亞群以及正常人外周動員血或臍血中CD34+細胞;②利用MTT法檢測濃度分別為0.08、0.16、0.32、0.64、1.25μM的DS及上述濃度的DS/Cu（Cu=1μM）對CD34+CD38-KG1a細胞的抑制增殖作用及明確DS和DS/Cu對CD34+CD38-KG1a細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50);③Annexin-V/PI雙標記流式細胞術檢測0.05、0.5、5μM的DS、DS/Cu

12、(Cu(=)1μM)以及DS/Cu聯(lián)合ROS抑制劑NAC(10mM)對CD34+CD38-KG1a細胞的誘導凋亡作用;④應用甲基纖維素集落形成實驗檢測濃度分別為0.01、0.1μM DS及DS/Cu(Cu=1μM)對CD34+CD38-KG1a細胞集落形成能力的影響;⑤利用DCFA法流式細胞術檢測濃度為0.5μM DS及DS/Cu(Cu=1μM)作用6h、12h、18h、24h后CD34+CD38-KG1a細胞中ROS水平的變化;⑥利用

13、Western Blot法測1μM Cu、0.5μM DS、0.5μM DS/Cu（Cu=1μM）以及0.5μM DS/Cu聯(lián)合ROS抑制劑NAC(NAC=10mM)作用CD34+CD38-KG1a細胞24h后細胞內NF-κB通路、JNK通路、Nrf2通路相關蛋白表達的變化;⑦利用實時熒光定量PCR法檢測0.5μM DS及0.5μM DS/Cu(Cu=1μM)處理CD34+CD38-KG1a細胞24h后Nrf2下游通路GSR、NQO1、

14、HO-1基因表達的變化，采用2-Δct法對PCR結果進行計算，分析上述基因的表達量與各種不同處理組的關系;⑧利用Annexin-V、CD34-APC、CD38-PE三標記流式細胞術檢測0.1、0.5μM的DS和DS/Cu(Cu=1μM)對磁珠分選后的CD34+CD38-原代AML細胞及HSC的誘導凋亡作用;⑨應用甲基纖維素集落形成實驗檢測0.01、0.05、0.1μMDS及DS/Cu對原代AML細胞及HSC集落形成能力的影響;⑩采用SP

15、SS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，多種處理因素作用比較采用析因方差分析;兩組間均數(shù)的比較使用獨立樣本t檢驗方法;多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析方法進行統(tǒng)計，在方差分析顯著的情況下使用LSD方法（方差齊性）進行多重比較;若方差不齊則采用近似F檢驗（如Welch方法）代替方差分析后采用Dunnett T3方法進行多重比較;計量資料用x±s表示，檢驗水準為α=0.05，雙側檢驗。
　　 結果：⑴DS和DS/Cu對CD34+CD38-K

16、G1a細胞有明顯的抑制增殖作用。MTT結果顯示24h的DS和DS/Cu的IC50分別為（0.54±0.18）μM和（0.21±0.028）μM;DS/Cu對CD34+CD38KG1a細胞的IC50顯著低于DS，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.107，P=0.036)，提示Cu可顯著增強DS對CD34+CD38-KG1a細胞的增殖抑制作用;⑵DS/Cu對CD34+CD38-KG1a細胞有誘導凋亡的作用?？瞻讓φ战M和單Cu組的凋亡率分別為（4.7

17、5±2.6）％、（5.6±4.0）％，DS和DS/Cu不同濃度組的凋亡率分別為[(7.69±3.44)％、(15.06±4.58)％、(32.67±6.06)％]和[(28.83±6.34)％、(42.33±3.21)％、(58.93±1.53)％]。經過統(tǒng)計分析，1μM單Cu對CD34+CD38-KG1a細胞沒有誘導凋亡作用;DS組中，0.05、0.5μM濃度組DS誘導CD34+CD38-KG1a細胞凋亡能力與對照組相比無顯著性差異，

18、而5μM濃度組可以顯著誘導CD34+CD38-KG1a細胞凋亡;DS/Cu組中，不同濃度的DS/Cu均可以誘導CD34+CD38-KG1a細胞凋亡(F=119.069，P=0.000)，且呈劑量依賴性。同一濃度下，DS和DS/Cu誘導CD34+CD38-KG1a細胞凋亡比例均顯著高于DS組，差異存在統(tǒng)計學差異(t=-5.078，P=0.007; t=-8.44，P=0.001; t=-7.279，P=0.002)。本實驗結果表明DS/C

19、u對CD34+CD38-KG1a細胞均存在顯著誘導凋亡作用，DS僅在高濃度情況下才能誘導CD34+CD38-KG1a細胞凋亡，DS/Cu誘導細胞凋亡的作用明顯強于DS。⑶DS及DS/Cu均能抑制CD34+CD38-KG1a細胞的集落形成。0.01、0.1μM的DS及DS/Cu(Cu=1μM)的集落形成單位百分比分別為[(97.19±10.19)％、（69.29±19.54）％]和[(48.55±14.36)％、（0.83±0.72）％]

20、。經統(tǒng)計分析， DS或者DS/Cu均能抑制細胞集落形成，且隨著濃度增加，CD34+CD38-KG1a的集落形成能力逐漸降低，DS/Cu組降低更加明顯，并表現(xiàn)劑量依賴性。同一濃度下DS和DS/Cu處理CD34+CD38-KG1a細胞后對細胞的集落形成能力的影響均存在統(tǒng)計學差異(t=4.777，P=0.009; t=6.066，P=0.004)。DS和DS/Cu均能抑制CD34+CD38-KG1a細胞集落形成能力，但DS/Cu抑制集落形成的

21、作用明顯強于DS。⑷DS及DS/Cu能下調NF-KB通路蛋白表達。DS單藥可明顯抑制胞核內P65蛋白的表達，而DS/Cu抑制P65蛋白表達的能力顯著強于DS單藥;同樣，DS單藥和DS/Cu均可抑制NF-κB通路下游c-myc、survivin蛋白的表達，而DS/Cu的抑制作用明顯強于DS單藥;⑸DS/Cu可誘導CD34+CD38-KG1a細胞內ROS蓄積。將0.5μM的DS和DS/Cu分別處理CD34+CD38-KG1a細胞6h、12h

22、、18h、24h后觀察細胞內ROS水平變化。結果示DS和DS/Cu作用不同時間后ROS水平分別為[(3180±127.3)％、(2489±345.8)％、(2538±373.0)％、(2569±224.08)％]和[(3431±33.7)％、(7145±488.51)％、(11227±438.6)％、(5853±857.5)％]，經統(tǒng)計分析，隨著作用時間延長，DS處理后CD34+CD38-KG1a細胞的ROS水平較對照組變化不明顯，而D

23、S/Cu組ROS水平逐漸升高，且在18h達到頂峰，24h后有一定下降;不同時間點DS/Cu組ROS生成水平均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，而DS組ROS水平與對照組間除6h組與對照組有差異外(P=0.000)，其余時間點與對照組相比無明顯差異(P=0.675; P=0.405; P=0.689)。本結果顯示DS單藥不能顯著誘導CD34+CD38-KG1a細胞內ROS蓄積，但在Cu離子聯(lián)同作用下可以誘導CD34+CD3

24、8-KG1a細胞內ROS蓄積，且這種蓄積隨著時間變化，并在18h時達到頂峰。⑹DS/Cu可以抑制Nrf2通路。以Western blot方法檢測各處理組作用24h后核內Nr￡2蛋白的變化，結果示DS單藥可以輕度抑制Nrf2表達，而DS/Cu抑制作用更明顯;實時熒光定量PCR方法分別檢測細胞內Nrf2通路下游基因HO-1、NQO1，GSR的表達水平，結果示DS/Cu均可以顯著抑制HO-1、NQO1、GSR基因mRNA的表達水平，與對照組相

25、比均有統(tǒng)計學差異(P=0.000; P=0.009;P=0.001)， DS不能顯著抑制NQO1基因的表達水平(P=0.243)，但可以顯著抑制HO-1及GSR基因的表達水平(P=0.009;P=0.001)。本結果表明DS/Cu可抑制Nrf2及其下游通路HO-1、NQO1，GSR基因的表達水平，DS單藥對Nrf2及其下游通路HO-1、NQO1，GSR基因的表達水平抑制能力顯著低于DS/Cu。⑺DS/Cu可以激活JNK通路。同樣以Wes

26、tern blot方法檢測作用24h后胞內JNK、p-JNK以及p-c-jun蛋白的變化，結果示JNK無明顯變化，而DS單藥及DS/Cu均能顯著增強p-JNK及p-c-jun的表達，其中DS/Cu處理組的作用更明顯。⑻ROS是DS/Cu對CD34+CD38-KG1a細胞產生誘導凋亡作用的關鍵。加入ROS抑制劑NAC后DS/Cu誘導CD34+CD38-KG1a細胞的凋亡率均出現(xiàn)不同程度下降，0.5μM濃度組從(36.42±2.86)％下降

27、(18.23±6.16)％，5μM濃度組從(53.99±9.34)％下降到（32.22±3.73）％。說明加入抗氧化劑NAC后，DS/Cu的誘導凋亡效應削弱了。同樣，利用Western blot比較DS/Cu和DS/Cu/NAC作用后細胞內p-JNK及Nrf2的變化，DS/Cu/NAC組的Nrf2蛋白的表達明顯弱于DS/Cu組;p-JNK蛋白的表達上調作用也明顯弱于DS/Cu組，說明NAC處理可以減弱DS/Cu對p-JNK的激活以及對N

28、rf2的抑制作用，提示DS/Cu可以通過ROS調控著JNK和Nrf2的表達。⑼DS/Cu能誘導CD34+CD38-原代AML細胞凋亡而對HSC(CD34+CD38-)作用較弱。0.1、0.5μM的DS和DS/Cu(Cu=1μM) DS及DS/Cu對CD34+CD38-原代AML細的凋亡率分別為[(12.50±4.97)％、(17.90±11.89)％]和[（24.83±5.78）％、（62.5±9.82）％]，DS及DS/Cu對HSC的

29、凋亡率為[（9.6±3.68）％、(10.4±3.53)％]和[(24.00±6.17)％、(23.77±10.80)％]。經統(tǒng)計分析，不同濃度的DS/Cu均可誘導CD34+CD38-原代AML細胞凋亡(F=42.834，P=0.000)，0.5μM濃度組也能誘導HSC凋亡(F=4.293，P=0.070)，但DS/Cu對兩種細胞的誘導凋亡能力存在顯著差異，對LSC的誘導凋亡作用顯著強于HSC(F=15.395，P=0.002)。不同濃

30、度的DS對CD34+CD38-原代AML細胞和HSC的誘導凋亡能力均不顯著(P＞0.05)。本結果顯示DS/Cu可以誘導CD34+CD38-原代AML細胞凋亡，但只有在高濃度情況下才會誘導HSC凋亡;DS單藥無顯著誘導CD34+CD38-原代AML細胞和HSC凋亡的能力。⑽低劑量的DS及DS/Cu均能抑制CD34+原代AML細胞集落形成而不影響HSC集落形成。不同濃度的DS及DS/Cu處理后原代AML細胞的CFU％分別為[(75.13±

31、13.84)％、(60.24±16.41)％、(20.63±12.08)％]和[（74.95±9.51）％、(44.53±13.31)％、(12.08±13.12)％]，DS及DS/Cu處理后HSC的CFU％為[(103.05±19.00)％、(93.81±7.78)％、(99.89±16.72)％]和[(96.31±20.60)％、(101.59±13.71)％、(92.10±10.23)％]。經統(tǒng)計分析，不同濃度的DS和DS/Cu均

32、可以抑制原代AML細胞集落形成(F=35.269，P=0.000，F(xiàn)=16.235，P=0.000)，而該濃度范圍內的DS及DS/Cu對正常外周血單個核細胞的集落形成并不存在影響(F=1.141，P=0.299;F=0.441，P=0.726)，說明DS及DS/Cu對兩種細胞的集落形成的抑制作用不同，對原代AML細胞的作用顯著強于正常細胞(F=54.591，P=0.000;F=5.842，P=0.007);本結果表明DS及DS/Cu均可