米諾環(huán)素對(duì)大鼠視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)及對(duì)GDNF和VEGF表達(dá)的影響.pdf

1、目的:視神經(jīng)損傷是臨床常見的眼外傷類型，可以導(dǎo)致嚴(yán)重的視力障礙甚至視力完全喪失，是眼科領(lǐng)域亟待解決的難題。既往認(rèn)為視神經(jīng)損傷后無再生能力，而近年來研究顯示，約有50％視神經(jīng)損傷患者能不同程度的恢復(fù)視力，表明視神經(jīng)損傷后在一定條件下可以再生。因此，尋找一種安全有效的藥物以延緩視神經(jīng)損害病變的發(fā)展迫在眉睫。米諾環(huán)素是一種第二代半合成四環(huán)素類抗生素，近年研究顯示，米諾環(huán)素(Minocycline，MC)對(duì)受損的神經(jīng)元有相當(dāng)強(qiáng)的保護(hù)作用。人們對(duì)

2、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，其在神經(jīng)系統(tǒng)的變性等疾病中具有抗炎、抗凋亡等作用，能夠通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞及前凋亡因子，拮抗谷氨酸的神經(jīng)毒性作用，從而提高神經(jīng)元的生存率，發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。動(dòng)物模型研究表明，米諾環(huán)素在腦中可達(dá)50％的血藥峰濃度，因此在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如腦缺血、腦外傷、萎縮性脊髓側(cè)索硬化、亨廷頓病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜疾病動(dòng)模型中均顯示有一定的神經(jīng)元保護(hù)作用。而且經(jīng)實(shí)踐證明，長(zhǎng)期口服米諾環(huán)素?zé)o明顯不良反應(yīng)、安全有效。

3、雖然米諾環(huán)素用在中樞神經(jīng)保護(hù)方面的研究日漸增加，但在視神經(jīng)損傷后，米諾環(huán)素能否發(fā)揮一定的神經(jīng)保護(hù)作用及作用機(jī)制尚不清楚，且在眼科視神經(jīng)保護(hù)方面的報(bào)道少見。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過采用視神經(jīng)夾傷模型建立大鼠視神經(jīng)損傷模型，并加以腹腔注射一定劑量的米諾環(huán)素進(jìn)行干預(yù)，應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)和免疫組化技術(shù)對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)

4、及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)進(jìn)行半定量測(cè)定，探討米諾環(huán)素對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用，從而為臨床治療視神經(jīng)損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:選用健康清潔級(jí)雄性SD大鼠50只（由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供），體質(zhì)量(200±20)g，適應(yīng)性喂養(yǎng)5d后查雙眼，屈光間質(zhì)清，瞳孔等大、等圓，對(duì)光反射靈敏，眼底無異常者入組，隨機(jī)分為三組:空白對(duì)照組10只，生

5、理鹽水對(duì)照組20只，米諾環(huán)素治療組20只。兩實(shí)驗(yàn)組均采用視神經(jīng)鉗夾法將左眼制成視神經(jīng)損傷模型，右眼為自身對(duì)照眼，之后行直接檢眼鏡檢查，眼底紅光反射正常，無缺血，無眼球突出，眼瞼閉合完全者為成功模型，右眼不予處理。
　　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物10％水合氯醛(35mg/kg)腹腔注射麻醉并經(jīng)常規(guī)無菌處理后，沿角鞏膜緣環(huán)形剪開顳側(cè)球結(jié)膜，鈍性分離暴露視神經(jīng)眶內(nèi)段，用標(biāo)定力量的反向鑷于球后2mm處鉗夾視神經(jīng)，致傷時(shí)間為20s，用10-0尼龍線縫合球

6、結(jié)膜2針，結(jié)膜囊內(nèi)涂氧氟沙星眼膏。米諾環(huán)素組、生理鹽水組于視神經(jīng)夾傷前1h及夾傷后每天腹腔分別注射米諾環(huán)素45mg/kg、等容量生理鹽水，空白對(duì)照組無特殊處理。
　　 分別于傷后1天、3天、7天、14天、28天多聚甲醛心臟灌注處死大鼠，立即摘除左眼眼球，鋸齒緣后0.5mm處剪開眼球壁，去除眼前節(jié)和玻璃體。用體積分?jǐn)?shù)為4％的多聚甲醛進(jìn)行固定，4℃冰箱過夜，眼杯行全層石蠟包埋，制備5～7μm視網(wǎng)膜切片，顯微鏡觀察并同步采集圖像。

7、r>　　 常規(guī)HE染色觀察視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化，并應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)(×400)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析（每張切片取4個(gè)視野，在距離視乳頭中心1.5mm處視網(wǎng)膜為觀察始點(diǎn)分別向四面各取1個(gè)視野，每個(gè)眼球取2張切片）。GDNF的檢測(cè)采用免疫組化半定量的方法，計(jì)算機(jī)圖像分析，并用多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)對(duì)視網(wǎng)膜中陽性反應(yīng)部位進(jìn)行分析，得出平均光密度值。
　　 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，平均光密度值及平均陽性細(xì)胞數(shù)結(jié)果均以(x)±s表示

8、，同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-wayANOVA)，不同組間同一時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行兩樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞蘇木精-伊紅染色結(jié)果:
　　 1.1、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變:空白對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜大致呈3層平行排列，分為神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、雙極細(xì)胞層及感光細(xì)胞層，視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞位于視網(wǎng)膜內(nèi)層，單層排列，細(xì)胞比較

9、致密，細(xì)胞核排列均勻整齊。生理鹽水對(duì)照組可見隨著損傷時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層胞核排列明顯紊亂，空泡化程度增強(qiáng)，雙極細(xì)胞層胞核數(shù)量也不同程度減少。比較而言，相同時(shí)間點(diǎn)米諾環(huán)素治療組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列相對(duì)整齊，空泡化程度相對(duì)較弱，雙極細(xì)胞層飽和數(shù)量相對(duì)較多。
　　 1.2、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量改變:正常對(duì)照組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)為29.9±0.10。生理鹽水對(duì)照組大鼠1天、3天、7天、14天、28天光鏡下每×400視野

10、平均視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目分別為:23.6±2.07個(gè)、18.2±0.84個(gè)、12.2±1.30個(gè)、7.4±2.19個(gè)、3.6±1.51個(gè)，米諾環(huán)素治療組大鼠1天、3天、7天、14天、28天光鏡下每×400視野平均視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目分別為:26.4±2.07個(gè)、21.8±2.59個(gè)、15.4±1.14個(gè)、11.8±1.64個(gè)、7.6±1.81個(gè)，相同時(shí)間點(diǎn)治療組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量均高于對(duì)照組，3天時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

11、意義(P＜0.05)，7天、14天、28天時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 2、視網(wǎng)膜GDNF和VEGF免疫組化半定量檢測(cè)結(jié)果:
　　 2.1、GDNF在視網(wǎng)膜中的表達(dá):大鼠視網(wǎng)膜中GDNF主要在各層細(xì)胞胞體表達(dá)，呈棕黃色，正常對(duì)照組視網(wǎng)膜組織中GDNF弱陽性表達(dá)，平均光密度值為0.1543±0.0060，各時(shí)間點(diǎn)無變化。生理鹽水對(duì)照組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層GDNF表達(dá)平均光密度值1天、

12、3天、7天、14天、28天的值分另為:0.2323±0.0024、0.2804±0.0040、0.2962±0.0022、0.3401±0.0021、0.2830±0.0027，米諾環(huán)素治療組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層GDNF表達(dá)平均光密度值1天、3天、7天、14天、28天的值分別為:0.2348±0.0036、0.2870±0.0041、0.3016±0.0022、0.3506±0.0060、0.2882±0.0023，視神經(jīng)夾傷后兩實(shí)驗(yàn)組均

13、有GDNF陽性表達(dá)，生理鹽水對(duì)照組表現(xiàn)為弱陽性;米諾環(huán)素治療組GDNF表達(dá)呈上升趨勢(shì)，14天后表達(dá)呈強(qiáng)陽性;生理鹽水對(duì)照組表達(dá)也隨時(shí)間有所增強(qiáng)，但14天時(shí)表達(dá)較治療組仍不明顯;相同時(shí)間點(diǎn)治療組GDNF陽性率均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.2、VEGF在視網(wǎng)膜中的表達(dá):大鼠視網(wǎng)膜中VEGF主要在各層細(xì)胞胞體、胞漿表達(dá)，呈棕黃色。正常對(duì)照組視網(wǎng)膜組織中VEGF弱陽性表達(dá)，平均光密度值為0.1598±0.

14、0055，各時(shí)間點(diǎn)無變化。生理鹽水對(duì)照組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層VEGF表達(dá)平均光密度值1天、3天、7天、14天、28天的值分別為:0.2266±0.0013，0.2276±0.0011，0.2909±0.0044，0.3209±0.0033，0.3427±0.0011;米諾環(huán)素治療組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層VEGF表達(dá)的平均光密度值1天、3天、7天、14天、28天的值分別為:0.2271±0.0017,0.2287±0.0007,0.3090±0

15、.0105,0.3256±0.0021,0.3488±0.0010。米諾環(huán)素治療組及生理鹽水對(duì)照組VEGF表達(dá)均呈上升趨勢(shì)，第1、3、7天時(shí)間點(diǎn)生理鹽水對(duì)照組較米諾環(huán)素治療組平均光密度值數(shù)值比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，從第14天開始米諾環(huán)素治療組VEGF表達(dá)的平均光密度值較生理鹽水對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），28天時(shí)間點(diǎn)時(shí)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的平均光密度值較生理鹽水對(duì)照組高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。