NKT細胞對不同嚴重程度支氣管哮喘的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:建立不同嚴重程度支氣管哮喘的小鼠模型,并在此基礎上研究自然殺傷T細胞(Natural killer T cells,NKT)在不同嚴重程度支氣管哮喘小鼠的作用,初步揭示NKT在支氣管哮喘發(fā)病中的機制,進而為探索支氣管哮喘治療的新方法奠定一定基礎。
  方法:利用不同濃度卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)激發(fā)致敏小鼠,建立不同嚴重程度支氣管哮喘小鼠模型,并利用α-半乳糖神經酰(α-galactosylceramide,α-

2、Galcer)激活NKT細胞對不同嚴重程度支氣管哮喘進行干預。將雌性BALB/c小鼠隨機分為5組,即生理鹽水(Normal saline,NS)組,1%OVA組、1%OVA+α-Galcer組,5%OVA組,5%OVA+α-Galcer組。于0d、14d給予各處理組小鼠腹腔注射OVA溶液致敏,同時NS組注射NS溶液做對照。在第25天霧化激發(fā)前1小時,NS組、1%OVA組和5%OVA組中每只小鼠用移液槍鼻腔滴入 NS,1%OVA+α-Ga

3、lcer組和5%OVA+α-Galcer組中每只小鼠用移液槍鼻腔滴入α-Galcer。第25,26,27天霧化吸入OVA進行激發(fā),NS組予NS霧化,1%OVA組和1%OVA+α-Galcer組予1%OVA霧化,5%OVA組和5%OVA+α-Galcer組予5%OVA霧化,霧化期間觀察小鼠行為學改變。最后一次霧化24小時后,用Buxco小鼠肺功能儀有創(chuàng)肺阻抗法測定小鼠的氣道反應性(Airway hyper reactivity,AHR);

4、然后眼球取血,應用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清OVA特異性IgE;并進行肺部灌洗,收集肺泡灌洗液(Bronchial lavage fluid,BALF),利用全自動細胞計數儀器記錄肺泡灌洗液中細胞總數。流式細胞術檢測BALF中各類細胞(包括中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞和嗜酸性粒細胞(Eosinophil,EOS))的比例。CBA法檢測小鼠BALF中細胞因子γ-干擾素(interferon,IFN-γ),白介素(Interle

5、ukin,IL)-4、-5和-13的水平。HE染色支氣管肺組織切片觀察氣道炎癥病理變化,根據血管、氣道周圍以及肺間質炎性表現(xiàn)情況不同進行評分(分值為0-3分)。
  結果:1.不同嚴重程度支氣管哮喘模型建立: NS組小鼠在霧化15min后出現(xiàn)輕微煩躁;1%OVA組小鼠在霧化8min出現(xiàn)煩躁不安、呼吸加深加快、頻繁抓口鼻和四肢、弓背直立、前肢縮抬行為學改變;5%OVA組小鼠霧化5min后出現(xiàn)上述更為明顯癥狀。1%OVA組和5%OVA

6、組小鼠肺組織病理改變、BALF中細胞總數及EOS比例、BALF中IL-4,-5,13水平、血清OVA特異性IgE水平和氣道阻力較NS組明顯升高(P<0.05或P<0.01),且5%OVA組較1%OVA組升高更為明顯(P<0.05或P<0.01)。2.α-Galcer干預后不同嚴重程度支氣管哮喘小鼠的行為學觀察:NS組小鼠在霧化15min后出現(xiàn)輕微煩躁及抓耳撓腮的癥狀;1%OVA組在霧化8min出現(xiàn)煩躁不安、呼吸加深加快、頻繁抓口鼻和四肢

7、、弓背直立、前肢縮抬等癥狀;1%OVA+α-Galcer組霧化10min后出現(xiàn)上述癥狀,程度減輕;5%OVA組在霧化5min后出現(xiàn)煩躁不安、呼吸加深加快、頻繁抓口鼻和四肢、弓背直立、前肢縮抬、點頭呼吸、大小便失禁等;5%OVA+α-Galcer組的在霧化8min后出現(xiàn)上述癥狀,程度減輕。3.α-Galcer干預后不同嚴重程度支氣管哮喘小鼠的組織病理學表現(xiàn):NS組小鼠支氣管、血管周圍及肺間質炎性細胞無明顯浸潤;與NS組相比,1%OVA組炎

8、性細胞輕度浸潤,見少許EOS,支氣管管腔不規(guī)則,肺泡腔融合,差異明顯(P<0.05);同1%OVA組相比,1%OVA+α-Galcer組有少許炎性細胞浸潤,幾乎無EOS浸潤,有顯著性差異(P<0.01);5%OVA組炎性細胞明顯浸潤,可見大量EOS,支氣管管腔不規(guī)則且狹窄明顯,周圍血管充血水腫,肺泡腔融合進一步擴大(P<0.01);同5%OVA組相比,5%OVA+α-Galcer組彌漫炎性細胞浸潤,大量的EOS,支氣管管腔不規(guī)則且狹窄明

9、顯,肺泡腔融合,無明顯統(tǒng)計學差異。4.α-Galcer干預后不同嚴重程度支氣管哮喘小鼠的BALF中細胞總數及EOS的改變:相對于NS組而言,不同濃度的OVA組小鼠BALF中細胞總數均明顯升高,同時5%OVA組BALF中細胞總數升高最多。對于不同嚴重程度的支氣管哮喘小鼠,α-Galcer治療均能有效降低BALF中的細胞總數(P<0.05)。5%OVA組小鼠的BALF中EOS比例較NS組、1%OVA組升高(P<0.01),但1%OVA組與N

10、S組無明顯差異(P>0.05),α-Galcer治療能夠降低1%OVA激發(fā)組BALF中EOS的比例(P<0.05),但在5%OVA激發(fā)組中沒有觀察到明顯效果。5.α-Galcer干預后不同嚴重程度支氣管哮喘小鼠BALF中細胞因子水平檢測:與NS組比較,不同濃度OVA激發(fā)能不同程度地升高小鼠BALF中IL-4,-5和-13的水平,同時降低BALF中IFN-γ的水平。α-Galcer治療能明顯降低1%OVA激發(fā)組模型小鼠BALF中IL-4和

11、IL-5的水平,升高IFN-γ的水平,但對5%OVA組小鼠作用較弱,無顯著性差異。6.α-Galcer干預后不同嚴重程度支氣管哮喘小鼠氣道反應性檢測:當組胺濃度為4mg/ml、8mg/ml時,1%OVA組和5%OVA組小鼠的氣道阻力較NS組明顯升高(P<0.01),低劑量組胺刺激時,5%OVA組較1%OVA組小鼠的氣道反應性明顯升高(P<0.05),而在高濃度組胺刺激時,兩組間無明顯差異(P>0.05);用不同濃度組胺刺激時,α-Gal

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