機械拉伸作用調(diào)節(jié)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向肌腱成纖維細胞定向分化的實驗研究.pdf

1、腱/韌帶是堅韌的結(jié)締組織,它們通過其結(jié)構(gòu)、力學(xué)性質(zhì)和外形的變化以響應(yīng)外力的刺激,在運動中起著重要作用,但活動范圍超過極限或拉扯過劇,腱/韌帶常常會受到損傷甚至斷裂,嚴(yán)重影響人們的健康。腱/韌帶損傷的治療目前仍然是整形外科中具有挑戰(zhàn)性的問題,比如如何加快治療速度、提高治療質(zhì)量直至完全治愈等等,都是臨床上亟待解決的難題。骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)是一類具有增殖和多向分化潛能的特殊細胞群。在某些特異

2、誘導(dǎo)條件下,骨髓間充質(zhì)干細胞在體外可增殖并分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和肌肉細胞等。這種分化可塑性為彌補臨床上腱/韌帶組織的缺乏帶來了希望,使腱/韌帶創(chuàng)傷的更好治療甚至組織工程化成為可能。但關(guān)于力學(xué)加載調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細胞向肌腱成纖維細胞定向分化的研究工作,至今尚未見詳細報道。為此,本文研制一種細胞體外拉伸加載的裝置,研究機械拉伸對骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化的調(diào)節(jié)作用,尋找調(diào)節(jié)骨髓干細胞定向分化為腱/韌帶成纖維細胞的機械拉伸加載條件

3、,并采用分子生物學(xué)等手段對分化過程中的標(biāo)志基因CollagenI(ColI)、CollagenIII(ColIII)、Tenascin(TNC)、Scleraxis(SCX)的表達變化進行定量描述。主要研究工作和結(jié)果如下:①大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(ratbone marrowme senchymalstem cells,rMSCs)的原代分離培養(yǎng)利用密度梯度離心結(jié)合差異貼壁法進行rMSCs的原代分離培養(yǎng),結(jié)果表明:1.073g/ml的pe

4、rcoll密度梯度離心結(jié)合差異貼壁分離得到的細胞為形態(tài)比較均一的單核細胞,用含10％胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后細胞開始貼壁,繼而分裂增殖,呈集落式生長,約2周后接近融合,呈紡錘形或長梭形的成纖維細胞樣形態(tài)。其間有漂浮不貼壁的造血細胞等雜細胞,在反復(fù)換液中被除去。傳代后細胞貼壁、生長較快,約一周可達到融合,呈長梭形或紡錘形均勻分布。考馬斯亮藍觀察細胞骨架結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)骨架蛋白呈藍色束狀

5、,而且其走向和細胞長軸平行。②rMSCs的鑒定和周期分析利用免疫染色方法考察了分離培養(yǎng)的細胞表面部分抗原的表達,利用流式細胞技術(shù)分析了細胞周期的分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn):細胞表面抗原CD34(造血干細胞標(biāo)記物)呈陰性;CD44和CD29呈陽性表達。細胞周期分析顯示G0/G1期細胞占(89.74±3.87)%,S期細胞占(2.49±2.2)%,G2/M期細胞占(7.7±3.7)%,表明大部分細胞處于非增殖狀態(tài)。③機械拉伸加載裝置的加工制作根據(jù)基底膜

6、形變原理,自行研制了單軸細胞拉伸裝置。實驗裝置由控制系統(tǒng)、機械系統(tǒng)、電機系統(tǒng)、冷卻系統(tǒng)和培養(yǎng)腔五個部分組成,實現(xiàn)拉伸-保持-恢復(fù)-保持-拉伸的單軸周期性拉伸加載方式。系統(tǒng)的綜合評價表明:該裝置運行穩(wěn)定,溫度可控,拉伸頻率及應(yīng)變大小可調(diào)(頻率范圍0.01-1.5HZ,應(yīng)變范圍0-50%),拉伸時間人為控制,操作簡便,可對細胞進行不同頻率、時間和應(yīng)變大小的拉伸加載。④拉伸加載對rMSCs向肌腱成纖維細胞定向分化的誘導(dǎo)本文考察了rMSCs在頻

7、率0.1Hz、形變大小10%的單軸縱向周期拉伸加載條件下的形態(tài)變化和相關(guān)基因的表達。結(jié)果表明:持續(xù)拉伸加載24h,rMSCs排列開始發(fā)生變化,拉伸48h,細胞變得細長,其排列方向和拉伸方向成60o至90o夾角,大部分細胞垂直于受力方向排列。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),和對照組(同樣條件的靜態(tài)培養(yǎng))比較,拉伸加載24h,ColI和ColIII表達明顯增加,但實驗組和對照組均沒有表達TNC和SCX。拉伸加載48h,ColI和ColIII的表達回到

8、對照組水平,但TNC和SCX在拉伸組rMSCs中表達,而對照組不表達TNC和SCX。結(jié)果表明,拉伸加載24h,ColI和ColIII在rMSCs中的表達迅速增加;拉伸加載48h,肌腱細胞特異標(biāo)記基因TNC和SCX等開始表達,表明rMSCs向肌腱成纖維細胞定向分化。實驗還進行了大鼠肌腱成纖維細胞的原代分離培養(yǎng),檢測了大鼠肌腱細胞相關(guān)標(biāo)志基因的表達情況。RT-PCR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),肌腱成纖維細胞大量表達ColI和ColIII,弱表達TNC和S