腦苷肌肽注射液誘導骨髓間充質干細胞分化為神經(jīng)元樣細胞的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:骨髓間充質干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),也稱骨髓基質細胞,是繼胚胎干細胞和神經(jīng)干細胞之后,又一種在體內外均能向神經(jīng)細胞分化的干細胞。具有向成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、神經(jīng)細胞等多向分化的能力,由于其具有取材方便,體外培養(yǎng)容易、易于誘導、易分離擴增、自身移植不產生免疫排斥等特點,MSCs成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病細胞治療或基因治療的種子細胞,是神經(jīng)細胞移植理想的供體。為了尋找更為理想的誘導骨髓間充質干細胞分

2、化為神經(jīng)元樣細胞的藥物及最佳誘導條件,本課題用腦苷肌肽注射液作為誘導劑,誘導MSCs向神經(jīng)細胞轉化,以期為MSCs用于神經(jīng)細胞移植提供理論與實驗依據(jù)。 方法 1.取雄性6周SD大鼠,麻醉處死后取雙側股骨和脛骨的骨髓,用貼壁培養(yǎng)法分離純化骨髓MSCs,傳代、擴增,以獲取更純化的MSCs,再連續(xù)觀察細胞形態(tài)及生長特性。 2.取生長良好的2、4、8代細胞,消化后調整細胞種植密度為(4.0×104/ml),接種于96孔板

3、,每孔250 ul,用唑鹽比色實驗(MTT)法每天固定時間測定細胞的吸光度(OD)值,連續(xù)7d。以時間(天)為橫坐標,OD值為縱坐標,繪制生長曲線,計算細胞倍增時間,并對三代細胞的OD值進行統(tǒng)計學分析。 3.用誘導劑腦苷肌肽注射液對MSCs進行誘導。在其他誘導條件不變的前提下,對比不同濃度的腦苷肌肽注射液對MSCs誘導后分化為神經(jīng)細胞比例的影響。按腦苷肌肽注射液的濃度分為以下幾組:1.25 ug/ml,2.5 ug/ml,5 u

4、g/ml,10 ug/ml,20 ug/ml,)于誘導后對細胞表達巢蛋白(Nestine),膠質原性纖維酸性蛋白(GFAP),神經(jīng)元烯醇化酶(NSE)的免疫組化的檢測。計算陽性細胞比例,進行統(tǒng)計分析,選出合適的誘導劑量;對比不同誘導時間對MSCs分化為神經(jīng)細胞比例的影響,按誘導時間分組:(3 d,5 d,7 d,10 d,14d,)通過免疫組化的方法進行檢測,并計算陽性細胞比例,進行統(tǒng)計分析,找出合適的誘導時間。 4 MSCs具

5、有多向分化潛能,為證明我們培養(yǎng)的細胞具有多向分化潛能,采用成骨細胞誘導液(10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉,10-8mmol/L地塞米松,50 mg/L維生素C,20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液)誘導MSCs 2周,行改良Gomori鈣鉆堿性磷酸酶檢測以鑒定成骨細胞形成。 結果: 1.分離得到的單個核細胞72 h貼壁,細胞多呈梭形,多角形,培養(yǎng)10-14 d可達80%融合。傳代細胞24 h內完全貼壁,細胞形態(tài)較均一,呈長梭

6、形,旋渦樣生長,一般5-8 d內可達80%融合。傳代細胞生長較原代要快,7 d即鋪滿培養(yǎng)瓶底,傳代細胞保持原代細胞的特征,隨代數(shù)增加,細胞得到純化,梭形細胞占到95%以上。 2.不同代骨髓MSCs的生長曲線第2、4、8代細胞生長曲線基本相同,呈S形。傳代后第1-2 d為細胞的生長滯留期,第3-6 d為對數(shù)生長期,約第8 d進入平臺期,細胞倍增時間約32 h。方差分析P>0.05 三代細胞間無統(tǒng)計學差異。表明骨髓MSCs體外穩(wěn)定擴

7、增,有很強的增殖能力。 3.腦苷肌肽注射液誘導MSCs為神經(jīng)元樣細胞用含濃度(1.25-20 ug/ml)的誘導劑進行誘導時,隨腦苷肌肽注射液濃度增高,Nestine、GFAP和NSE陽性細胞比例也呈現(xiàn)逐步增高趨勢,經(jīng)免疫組化檢測及統(tǒng)計分析,腦苷肌肽注射液濃度為(5ug/ml)時,能夠誘導Nestine、GFAP和NSE陽性細胞比例為(33.57±0.63)%(61.57±2.45)%、(32.50±0.46)%,顯著高于對照組

8、P<0.01。誘導時間3 d~14d,隨時間的延長三種陽性細胞的比例也呈現(xiàn)逐步增高趨勢,經(jīng)免疫組化檢測及統(tǒng)計分析,誘導時間為10 d時,能夠誘導Nestine、GFAP和NSE陽性細胞比例為(34.54±1.01)%、(62.71±0.33)%、(32.19±0.38)%,顯著高于對照組(P<0.01)。 4 向成骨細胞誘導向成骨細胞誘導2周后,實驗組堿性磷酸酶染色陽性,對照組堿性磷酸酶染色為陰性。 結論 1.實

9、驗中分離培養(yǎng)的單個核細胞呈貼壁生長,成纖維細胞樣外觀,具有典型的形態(tài)特點,并證明其可以同時向神經(jīng)元樣細胞和成骨細胞分化,具有多向分化潛能,表明從骨髓分離培養(yǎng)的細胞為骨髓間充質干細胞。 2.腦苷肌肽注射液是一種很好的體外誘導劑,可以誘導MSCs向神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質細胞分化,以5 ug/ml腦苷肌肽注射液作誘導劑,能夠獲得較明顯的誘導的MSCs向神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質細胞分化的結果,誘導10 d后MSCs能有效向神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質細胞分

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