大鼠腦缺血后大腦皮層長鏈非編碼RNA的表達譜研究.pdf

1、研究背景:
　　 腦卒中是以腦部缺血及出血性損傷癥狀為主要臨床表現(xiàn)的疾病，俗稱腦中風。腦卒中具有極高的病死率和致殘率，其中缺血性腦梗塞約占中風發(fā)病率的85％。全球每年約有600萬人死于腦卒中，是全世界導致死亡的第二病因。根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，我國腦卒中發(fā)生率正以每年8.7％的速度上升，比美國高出一倍，每年約新增130萬例腦血管病、死亡近100萬人，已成為居民第一位死亡原因。幸存者中約3/4的人留下偏癱等后遺癥狀，部分病人喪失勞動

2、能力和生活能力，給家庭帶來沉重的經(jīng)濟負擔和精神壓力，給社會帶來的經(jīng)濟損失達400多億元（中國疾病預防控制中心，2012）。因此，腦卒中的預防和治療已成為現(xiàn)代醫(yī)學科學研究的重大課題之一。
　　 近幾十年來，雖然大量科研人員致力于腦缺血后病理損傷機制的研究，但目前仍未完全闡明。針對腦缺血病理損傷機制中的某個靶點開發(fā)的治療候選藥物的臨床試驗療效都不理想，導致臨床試驗失敗的主要原因是腦缺血后的病理損傷機制復雜以及各種損傷機制之間的級聯(lián)和

3、網(wǎng)絡關系尚不明確，因此，針對某個靶點的研究策略也受到了質疑。目前還沒有一種候選藥物能同時針對多種損傷機制而發(fā)揮減輕腦缺血后損傷的作用，從而降低腦缺血患者的致殘率，減輕后遺癥。通過新機制研究發(fā)現(xiàn)新的治療靶點是科研人員一直努力的方向。
　　 近年來，高通量技術和生物信息學分析技術越來越多的應用于解決生物學問題，尤其是應用于人類疾病的研究。這種以數(shù)據(jù)為導向，大規(guī)模、工業(yè)化、整體化的研究模式，使得從基因組(Genomics)水平、轉錄組

4、((Transcriptomics)水平、蛋白質組(Proteomics)水平對疾病展開全方位、多層次的研究和分析成為可能。轉錄組是連接基因組遺傳信息與生物功能的必然紐帶，轉錄組研究已經(jīng)成為揭示疾病基因變化規(guī)律、疾病發(fā)生發(fā)展機制、發(fā)現(xiàn)致病基因關鍵調控靶點等領域的最佳研究手段，廣泛應用于疾病預防、診斷、個性化治療和預后等領域。
　　 大量新近的實驗結果表明，真核生物中存在著大量來源于非編碼DNA的轉錄產(chǎn)物——“非編碼RNA(non

5、-coding RNAs，ncRNAs)”，它們不僅數(shù)量眾多，是生命活動的重要信息載體，并且能在多種生命活動中發(fā)揮重要的調控作用，是轉錄組學研究的重要組成部分，也使人類對基因組的認識和研究上升到了更加深入的領域。在過去的幾年里，非編碼RNA研究取得了很大的進步，但大部分工作都集中在microRNA(miRNA)等小分子非編碼RNA，對于長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNAs)的研究相對較少。lncRN

6、As是一類轉錄本長度超過200nt，但并不編碼蛋白或者只是編碼很短多肽的基因轉錄產(chǎn)物，它們以RNA的形式在多種層面上發(fā)揮調節(jié)作用，如基因組印記以及染色質修飾，轉錄激活，轉錄后調控，蛋白功能調節(jié)等。正因為lncRNAs廣泛的分子生物學功能，lncRNAs可從多方面調控基因，從而發(fā)揮多靶點的作用，為探討復雜疾病的病理機制提供了一個新的研究領域。lncRNAs與疾病之間的關系已得到越來越多的關注，lncRNAs在腫瘤，神經(jīng)退行性疾病中的研究結

7、果顯示，lncRNAs有望成為疾病診斷和預后的分子標志物，在疾病治療方面也有望成為同時針對多個蛋白和信號通路的治療靶點。
　　 microRNA水平探討腦缺血后病理損傷機制已有報導，而且隨著研究的深入，一些腦缺血誘導的特異性miRNA，如miRNA-233，miR-497具有神經(jīng)元保護作用，可以作為很有希望的治療靶點。相對于microRNA，lncRNAs在缺血性腦卒中的研究較少，國外僅有一篇關于腦缺血后lncRNAs的研究報導

8、，且該研究僅處在初步的數(shù)據(jù)積累階段，并未對腦缺血誘導的lncRNAs在病理損傷級聯(lián)過程中的可能作用進行深入分析和探討。影響腦缺血后病理過程的因素較多，如缺血時間、缺血后時間長短等，因此有必要對腦缺血后lncRNAs的表達情況進行更全面的研究。
　　 本課題猜想:(1)鑒于lncRNAs在細胞內具有廣泛的生物學功能，lncRNAs在腦卒中損傷級聯(lián)中必有重要作用;(2)高通量芯片技術的完善，使我們可以在基因組全局水平研究與疾病相關的

9、分子機制，通過研究缺血性腦卒中l(wèi)ncRNAs的表達情況，開啟我們對腦缺血后損傷機制研究的另一個新領域，使我們對腦缺血損傷機制的認識上升到更高水平;(3)對比腦缺血模型大鼠大腦缺血半影區(qū)與假手術模型大鼠大腦相同部位lncRNAs的表達譜，篩選出腦缺血誘導的、特異性表達的lncRNAs;(4)通過構建lncRNAs-mRNAs共表達網(wǎng)絡、基因位點分析、KEGG通路分析及GO分析等生物信息學分析技術，分析大腦皮層缺血半影區(qū)差異表達的lncRN

10、As在缺血性腦卒中后損傷級聯(lián)中的可能作用，篩選出候選研究目的lncRNAs，為研究缺血性腦卒中損傷的lncRNAs機制及發(fā)現(xiàn)新的治療靶點奠定基礎。
　　 研究目的:
　　 (1)我們采用大鼠局部腦缺血再灌注損傷模型模擬缺血性腦卒中，假手術組做對照，通過高通量芯片研究大腦皮層缺血半影區(qū)lncRNAs表達譜，篩選出差異表達lncRNAs。
　　 (2)通過生物信息學分析技術，進一步分析差異lncRNAs在腦卒中后病理

11、損傷級聯(lián)過程中的可能作用，篩選出腦缺血后病理損傷過程中具有潛在關鍵調控作用的lncRNAs。
　　 (3)為了進一步驗證實驗結果的可重復性和芯片結果的可靠性，同時為了排除手術操作時動物應激反應的影響因素，我們采用一組新樣本，并設立正常對照組，使用RT-PCR進行驗證，明確候選研究lncRNAs的表達情況，為進一步研究候選目的lncRNAs的功能和機制奠定基礎，為尋找新的治療靶點提供科學依據(jù)。
　　 研究內容:
　　

12、 第一章局部腦缺血再灌注模型大鼠大腦皮層lncRNAs表達譜研究
　　 目的:
　　 缺血性腦卒中病理損傷過程中l(wèi)ncRNAs表達譜已有研究，但由于實驗動物物種的不同、取樣部位差異或取樣時間點、實驗技術平臺的不同，實驗結果會存在較大差別。通過高通量芯片技術研究局部腦缺血再灌注損傷模型大鼠大腦缺血半影區(qū)和假手術大鼠大腦相同部位組織lncRNAs的表達譜，篩選差異表達的lncRNAs，為腦缺血誘導的lncRNAs提供數(shù)據(jù)積

13、累。
　　 方法:
　　 建立局部腦缺血再灌注損傷大鼠模型(N=3)，缺血1h，再灌注24h;假手術組做對照(N=3)。分別提取模型組缺血半影區(qū)和假手術組相同部位腦組織的總RNA，純化，檢驗RNA質量后，合成生物素標記的cRNA。利用美國Arraystar公司大鼠lncRNAs芯片技術檢測各組lncRNAs和mRNAs的表達情況，對原始數(shù)據(jù)進行預處理、均一化后進行統(tǒng)計學分析。對比模型組與假手術組數(shù)據(jù)，以2倍以上變化且具有

14、統(tǒng)計學意義(P＜0.05）為判斷標準，篩選出差異表達的lncRNAs和mRNAs。對差異表達的mRNAs進行GO分析和KEGG通路分析。
　　 結果:
　　 美國Arraystar公司大鼠lncRNAs芯片共包含9300個lncRNAs探針和15200個mRNAs探針，因此在檢測lncRNAs表達譜的同時也檢測了mRNAs的表達譜。對芯片原始數(shù)據(jù)進行標準化處理和兩組比較后，差異表達的lncRNAs為1213個，占檢測ln

15、cRNAs的13.04％，其中上調373個，下調840個;5倍以上變化的共101個，其中上調65個，下調36個;10倍以上變化的共18個，其中上調14個，下調4個。
　　 差異表達的mRNAs共1894個，占檢測mRNAs的12.46％，其中上調1081個，下調813個;5倍以上變化的mRNAs共346個，上調289個，下調57個;其中6個mRNAs（Ref-Seq ID號），NM_001007612，NM_001109536，

16、NM031530，NM012953，NM030845，NM012620上調100倍以上。
　　 結論:
　　 局部腦缺血后大鼠大腦皮層缺血半影區(qū)lncRNAs和mRNAs表達譜發(fā)生了顯著變化。部分差異表達的mRNAs與已有的研究結果相同，GO分析和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，差異表達的mRNAs主要與炎癥反應和免疫反應有關，這與已知的腦卒中的病理損傷過程相符，在一定程度上說明了芯片結果的可靠性，可對篩選得到的差異lncRNAs

17、進行后續(xù)分析。
　　 第二章生物信息學分析技術挑選研究目的基因
　　 目的:
　　 高通量芯片篩選出1213個差異表達的lncRNAs和1894個差異表達的mRNAs，由于lncRNAs的相關研究資料有限，不能為挑選候選研究的lncRNAs提供參考，發(fā)現(xiàn)與研究目的密切相關的lncRNAs是一個挑戰(zhàn)。通過構建lncRNAs-mRNAs共表達網(wǎng)絡、基因位點分析等一系列生物信息學分析技術，發(fā)現(xiàn)在腦缺血病理損傷進程中起關

18、鍵作用的lncRNAs，作為深入研究的候選基因。
　　 方法:
　　 生物在不同狀態(tài)下，基因的表達情況不同，基因間的相互關系也不同。不同的子網(wǎng)絡模塊必然與生物當前的功能狀態(tài)密切相關。通過權重基因共表達網(wǎng)絡分析法(Weighted Correlation Network Analysis)構建差異基因的lncRNAs-mRNAs共表達網(wǎng)絡。比較模型組和假手術組各自的lncRNAs-mRNAs共表達網(wǎng)絡，可發(fā)現(xiàn)同一基因在不同

19、網(wǎng)絡中與其他基因的關聯(lián)程度不同，包括關聯(lián)的基因個數(shù)不同，關聯(lián)的基因也可能不同。因此，根據(jù)基因在模型組和假手術組中的關聯(lián)度差異，以關聯(lián)度差異≥0.5為判斷標準，篩選出關聯(lián)度差異較大的lncRNAs。
　　 分析關聯(lián)差異較大lncRNAs的子網(wǎng)絡，根據(jù)lncRNAs關聯(lián)mRNAs的功能，大致推斷l(xiāng)ncRNAs與腦缺血后病理損傷的密切性。因為lncRNAs發(fā)揮作用的機制可能與lncRNAs鄰近的蛋白編碼RNA有關，因此再對lncRNA

20、s的基因位點進行分析，最終選定研究目的lncRNAs。
　　 結果:
　　 模型組和假手術組lncRNAs-mRNAs共表達網(wǎng)絡的結構和形狀有很大差別，說明腦缺血病理組織和假手術組織中mRNAs和lncRNAs的共表達關系幾乎完全不一樣。比較兩組網(wǎng)絡中相同基因度的變化，以模型組與假手術組差異≥0.5為標準，共篩選出205個lncRNAs，其中上調41個，下調164個。子網(wǎng)絡分析和基因位點再分析后，最后確定BC168687

21、， BC081976，MRAK16399，MRAK051903作為后續(xù)研究的目的lncRNAs。
　　 結論:
　　 通過構建lncRNAs-mRNAs基因共表達網(wǎng)絡聯(lián)合基因位點分析的方法，能從大量芯片結果中挑選出與研究目的密切相關的lncRNAs，這為芯片結果的進一步挑選提供了新方法。通過生物信息學分析方法挑選的研究目的lncRNAs-BC168687，BC081976，MRAK16399，MRAK051903具有很好

22、的研究前景。
　　 第三章實驗結果及研究目的基因的RT-PCR驗證
　　 目的:
　　 為了進一步證明芯片實驗結果的可靠性和可重復性，同時為了排除模型制作時大鼠的應激反應引起候選lncRNAs改變的可能性，我們采用一組新的大鼠腦缺血模型和假手術標本，并同時設立正常大鼠對照組，對4個研究目的lncRNAs及其他5個lncRNAs進行RT-PCR驗證，明確基因的表達情況。
　　 方法:
　　 建立大鼠

23、局部腦缺血再灌注損傷模型(N=3)，假手術組(N=3)和正常組(N=3)。取大腦皮層相同部位組織，提取RNA，測定RNA的濃度和純度。設計待驗證lncRNAs的逆轉錄引物和PCR擴增引物，GAPDH作為內參。提取的RNA用特異設計的引物進行逆轉錄，反應后得到的cDNA溶液用于PCR擴增，每個樣本重復三次，每次三個復孔。以正常組為對照，采用2-△△Ct法計算各基因的相對表達量。用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對各組目的基因的2-△△Ct進行統(tǒng)計

24、分析，采用方差分析對樣本間的均數(shù)進行比較。數(shù)據(jù)方差齊性檢驗，如Levene檢驗方差齊性(P＞0.05)，組間比較采用one-way ANOVA、組間多重比較采用LSD分析;如果方差不齊(P＜0.05)，組間比較則選擇方差不齊的近似F檢驗Welch法、組間多重比較采用Dunnett T3法分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 對各組目的基因的2-△△Ct進行統(tǒng)計分析。lncRNAs-MRAK045

25、258:方差分析結果表明模型組、假手術組和正常對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(F=242.468，P＜0.001)。模型組與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，模型組與假手術組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001);假手術與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.058)。
　　 lncRNAs-MRAK134201:方差分析結果表明模型組、假手術組和正常對照組之間差異有統(tǒng)計學意義（F=28.540，P＜0.001）。

26、模型組與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，模型組與假手術組相比差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003);假手術與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.44)。
　　 lncRNAs-MRUC008bux:方差分析結果表明模型組、假手術組和正常對照組之間差異有統(tǒng)計學意義（F=27.560，P=0.01）。模型組與正常對照組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001)，模型組與假手術組相比差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001);假手術

27、與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.626)。
　　 lncRNAs-BC168867:方差分析結果表明模型組、假手術組和正常對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(F=135.735，P＜0.001)。模型組與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，模型組與假手術組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）;假手術與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.718)。
　　 lncRNAs-AY383677:方差分析結果

28、表明模型組、假手術組和正常對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(F=16.566，P=0.004)。模型組與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001≤0.001)，模型組與假手術組相比差異有統(tǒng)計學意義(P=0.007);假手術與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.163)。
　　 lncRNAs-MRAK051903:方差分析結果表明模型組、假手術組和正常對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(F=132.180，P＜0.001)。模型組與

29、正常對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），模型組與假手術組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001);假手術與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.582)。
　　 lncRNAs-uc318+:方差分析結果表明模型組、假手術組和正常對照組之間差異有統(tǒng)計學意義（F=68.613，P＜0.001）。模型組與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，模型組與假手術組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001);假手術與正常對

30、照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.378)。
　　 lncRNAs-MRAK16399:方差分析結果表明模型組、假手術組和正常對照組之間差異有統(tǒng)計學意義（F=79.616，P＜0.001）模型組與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，模型組與假手術組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001);假手術與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.47)。
　　 lncRNAs-BC079432:方差分析結果表明模型組、

31、假手術組和正常對照組之間差異有統(tǒng)計學意義（F=71.262，P=0.002）。模型組與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P=0.01)，模型組與假手術組相比差異有統(tǒng)計學意義(P=0.007);假手術與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.914)。
　　 結論:
　　 新一組樣本的RT-PCR結果與芯片結果具有很好的一致性，說明實驗具有可重復性，芯片結果可靠，芯片提供的大量篩選結果可為后續(xù)研究提供指導。各目的基因在假手術