瘢痕疙瘩成纖維細胞電離輻射效應及誘導細胞早期衰老相關基因表達研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　瘢痕疙瘩是遺傳易感性患者皮膚損傷后組織異常修復的結果，僅見于人類，亞洲人群多發(fā)，無合適動物模型。對各種治療抵抗，復發(fā)率高，是目前皮膚科和整形美容外科的治療難點之一。瘢痕疙瘩手術切除后早期結合電離輻射較其它治療方案更為有效，且復發(fā)率和電離輻射總劑量顯著相關。瘢痕疙瘩組織內最主要的功能細胞-成纖維細胞的異常增殖、分泌過多細胞外基質的特征性生物學行為，是瘢痕疙瘩形成過程中的重要因素，存在與腫瘤細胞相似的表觀遺傳學改

2、變。本文擬通過瘢痕疙瘩與正常人皮膚及培養(yǎng)的原代成纖維細胞比較，闡明瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展過程中，是否存在多個基因及其相關途徑的相互作用？部分基因是否存在表觀遺傳學相關改變，影響其表達，繼而出現增殖、細胞周期、細胞代謝功能改變？不同劑量電離輻射是否部分針對這些環(huán)節(jié)，逆轉相應基因表達，在電離輻射后不同階段誘導瘢痕疙瘩成纖維細胞出現凋亡、衰老或其他表現型，繼而產生治療作用。本研究在表觀遺傳學領域，探討不同劑量和時間電離輻射治療瘢痕疙瘩的相關機制，

3、為瘢痕疙瘩診療提供新的思路、治療靶點和潛在治療方案。
　　研究方法和材料：
　　1、不同臨床分期瘢痕疙瘩患者入組，簽署知情同意書，判斷瘢痕疙瘩嚴重程度，作分類積分及所處階段評價，建立瘢痕疙瘩患者和相匹配正常人皮膚的原代成纖維細胞株，并經成纖維細胞鑒定，MTT/CCK-8比色法繪制生長曲線，分析其增殖，流式細胞儀檢測細胞周期，通過測定兩種原代成纖維細胞培養(yǎng)基上清液中羥脯氨酸含量明確膠原產生區(qū)別。
　　2、瘢痕疙瘩及其成纖

4、維細胞p16基因啟動子區(qū)功能失常的表觀遺傳學研究，分析其與瘢痕疙瘩嚴重程度及臨床分期的相關性。取瘢痕疙瘩皮損及培養(yǎng)的原代成纖維細胞行亞硫酸氫鹽修飾后測序（BSP法），檢測p16基因甲基化狀態(tài)。實時熒光定量PCR判斷兩種原代成纖維細胞DNA甲基轉移酶(DNMTs)、p16、p21、p27基因表達區(qū)別。并用免疫組化方法檢測皮損組織中p16、p21、p27、p53等細胞周期激酶抑制劑表達情況。比較瘢痕疙瘩皮損組織和正常皮膚及成纖維細胞源性腫瘤

5、-纖維肉瘤的病理區(qū)別，通過增殖細胞核抗原Ki-67免疫組化染色檢測瘢痕疙瘩和纖維肉瘤的增殖差異。
　　3、電離輻射誘導瘢痕疙瘩成纖維細胞過早衰老及其相關基因表達改變:通過不同劑量(0、2、4、6、8Gy)、電離輻射后不同時間(3、6、12、24、48、72、96 h)的作用，采用MTT/CCK-8比色法、臺盼藍染色分析、流式細胞儀檢測輻照前后細胞形態(tài)、細胞周期分布、細胞增殖和存活能力變化;實時熒光定量PCR檢測p16、p21、p2

6、7、DNMTs、I型前膠原mRNA變化;Westemblot法檢測這些基因蛋白質水平改變，通過測定培養(yǎng)基上清液中羥脯氨酸含量明確電離輻射前后膠原總體水平變化;同時應用p-半乳糖苷酶染色檢測貼壁瘢痕疙瘩成纖維細胞衰老。根據增殖抑制情況，p16、p21、p27和I型前膠原基因表達，及與細胞周期分布的相關性，判斷抑制效應最為顯著的電離輻射劑量和時間。
　　研究結果
　　1、瘢痕疙瘩患者入組12例，患者組和對照組在性別及年齡構成比上

7、無顯著性差異。原代培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞(KFb)8例，正常人皮膚原代成纖維細胞(NFb)6例;在細胞學水平，KFb細胞雖然形態(tài)和NFb細胞相似，但KFb細胞增殖與膠原產生能力明顯高于NFb細胞，與NFb相比，KFb處于G2/M期的比例顯著增高，而G0/G1期比例則明顯低于NFb。
　　2、瘢痕疙瘩皮損及其成纖維細胞中p16基因啟動子區(qū)存在甲基化狀態(tài)，與正常皮膚細胞及腫瘤細胞均存在差異。KFb細胞中三種DNMTs基因和NFb細胞相

8、比均存在高表達，細胞和組織中細胞周期相關基因p16、p21、p27低表達，組織中P53蛋白高表達。瘢痕疙瘩皮損真皮處部分Ki-67表達陽性率高于正常皮膚，遠低于成纖維細胞源性腫瘤，纖維肉瘤，且不具備其異型性，膠原含量、核漿比、核分裂像等都有差異。
　　3、電離輻射抑制兩種成纖維細胞增殖，存在劑量和時間依賴模式，與NFb細胞相比，KFb細胞增殖抑制率更高。輻照后KFb細胞G0/G1期比例逐漸增高，出現G1期阻滯。4Gy電離輻射后72

9、小時，衰老特異的β-半乳糖苷酶陽性，瘢痕疙瘩成纖維細胞呈衰老表現型，隨時間延長，衰老細胞陽性比例增多。KFb細胞膠原產生能力降低。細胞周期相關基因p16、p21、p27 mRNA和蛋白水平明顯升高，分別在24小時和48小時表達出現高峰。輻照后KFb細胞DNMTs基因表達降低。
　　結論
　　瘢痕疙瘩中存在DNA甲基化狀態(tài)改變，通過調控細胞周期相關基因轉錄表達，影響成纖維細胞增殖和膠原合成。研究提示瘢痕疙瘩中存在多個基因的相互