Wnt-1信號通路靶蛋白(WISP-1)各結構域蛋白的原核表達、純化及可能介導食管癌放療抵抗的關鍵結構域蛋白的噬菌體文庫篩選.pdf

1、目的:
　　采用基因克隆表達技術，使用pFN19A(HaloTag(R)) T7 SP6 Flexi載體，分別構建WISP-1四個結構域蛋白的pFN19A(HaloTag7)T7 SP6 Flexi載體，分別標記為pFN19A Halo-IGFBP，Halo-VWFC，Halo-TSP，Halo-CTCK，含有Halo標簽的蛋白位于WISP-1四個結構域蛋白的氨基末端;通過一步法(KRX)感受態(tài)細胞用于對構建好的載體進行有效轉化;

2、將誘導表達的帶有HaloTag的WISP-1四個結構域蛋白用HaloLink樹脂進行高效并特異性的共價固定，使用TEV蛋白酶從HaloLink樹脂上將WISP-1各結構域蛋白切下，從而使HaloLink樹脂與目的蛋白分離開，這樣就獲得了純度較高的WISP-1各結構域的蛋白，通過克隆形成實驗，在細胞層面找到可能介導食管癌細胞發(fā)生放療抵抗的關鍵結構域，采用噬菌體文庫篩選技術，篩選出能夠與特定結構域蛋白特異結合的噬菌體，為后續(xù)研究靶向針對WI

3、SP-1蛋白的藥物多肽奠定基礎。
　　方法:
　　1.構建并鑒定表達質(zhì)粒(pFN19A Halo-IGFBP, Halo-VWFC, Halo-TSP, Halo-CTCK):
　　采用基因克隆表達技術，采用蛋白質(zhì)編碼序列定向克隆的方法，應用VectorNTI10.0生物學軟件對編碼WISP-1四個結構域蛋白的cDNA堿基序列進行密碼子優(yōu)化，含有Halo標簽的原始質(zhì)粒購自美國Promega公司，通過酶切、連接反應，將其

4、克隆到表達質(zhì)粒pFN19A(HaloTag(R)) T7 SP6 Flexi中，構建出新的原核表達質(zhì)粒pFN19A Halo-IGFBP，Halo-VWFC，Halo-TSP，Halo-CTCK，并通過菌落PCR，、酶切鑒定、DNA測序，鑒定構建的質(zhì)粒。
　　2.WISP-1四個結構域融合蛋白的誘導與純化:
　　將構建好的原核表達質(zhì)粒pFN19A Halo-IGFBP，Halo-VWFC，Halo-TSP，Halo-CTCK

5、轉化至感受態(tài)表達菌KRX中，挑取經(jīng)過驗證的單克隆菌加入含有Amp的LB中擴增，當菌體A值達到0.4-0.5時加入鼠李糖至終濃度為0.05％，根據(jù)優(yōu)化后的條件25-37℃誘導過夜，第二天離心沉淀菌體，用蛋白純化液重懸菌體，超聲破菌，按照Halo蛋白純化系統(tǒng)的策略進行目的蛋白的純化，得到WISP-1四個結構域蛋白后采用考馬斯亮藍及WB對蛋白進行鑒定。
　　3.各結構域蛋白對食管鱗癌細胞株KYSE-150放療抵抗的初步研究
　　將

6、純化后得到的四個結構域的蛋白分別加入食管鱗癌細胞株KYSE-150中，對細胞進行放療并設置劑量梯度，通過克隆形成實驗找到對KYSE-150細胞株發(fā)生放療抵抗的關鍵結構域蛋白.
　　4.篩選出能夠與關鍵結構域特異性結合的噬菌體
　　確定了關鍵結構域蛋白后，通過噬菌體篩選技術，得到可能能夠與關鍵結構域蛋白相結合的噬菌體，采用ELISA法檢測陽性的噬菌體克隆，最終得到能夠與關鍵結構域蛋白特異結合的單克隆噬菌體。
　　結果:<

7、br>　　1.WISP-1四個結構域融合蛋白表達質(zhì)粒的構建及鑒定:
　　菌落PCR、酶切分析、DNA測序等實驗的鑒定結果與預期相符，成功構建了WISP-1四個結構域融合蛋白的原核表達質(zhì)粒，分別標記為:pFN19A Halo-IGFBP，Halo-VWFC, Halo-TSP, Halo-CTCK;
　　2.WISP-1四個結構域融合蛋白的誘導與純化:
　　WB和考馬斯亮藍染色顯示在45kD分子量大小有一特異性的目的條帶

8、，與融合蛋白Halo-IGFBP/VWFC/TSP/CTCK理論分子量相符，說明融合蛋白成功在大腸桿菌KRX中表達;按照Halo蛋白純化系統(tǒng)的策略進行目的蛋白的純化，得到WISP-1四個結構域蛋白后采用考馬斯亮藍及WB對蛋白進行鑒定。
　　3.四個結構域蛋白與食管鱗癌細胞株KYSE-150放療后的克隆形成實驗
　　將純化后得到的四個結構域的蛋白(IGFBP/VWFC/TSP/CTCK)分別加入食管鱗癌細胞株KYSE-150中

9、，對細胞進行放療并設置劑量梯度，分別為0Gy、2Gy、4Gy、6Gy和8Gy，通過克隆形成實驗找到WISP-1蛋白介導KYSE-150細胞株發(fā)生放療抵抗的關鍵結構域蛋白為WFC.
　　4.與VWFC結構域特異性結合的噬菌體
　　確定了關鍵結構域蛋白(VWFC)后，通過噬菌體文庫篩選技術，得到可能能夠與VWFC結構域蛋白相結合的噬菌體，采用ELISA法檢測陽性的噬菌體克隆，最終得到了5個能夠與VWFC結構域蛋白特異結合的噬菌體

10、單克隆。
　　結論:
　　成功構建了WISP-1四個結構域融合蛋白的原核表達質(zhì)粒(pFN19AHalo-IGFBP，Halo-VWFC，Halo-TSP，Halo-CTCK)，將構建好的質(zhì)粒轉化至大腸桿菌KRX中，采用HaloTag蛋白純化系統(tǒng)對目的蛋白進行純化，經(jīng)過考馬斯亮藍及WB對蛋白進行鑒定，成功獲得了產(chǎn)量大、純度較高并具有功能的WISP-1各結構域的可溶性蛋白，通過克隆形成實驗找到介導放療抵抗的關鍵結構域蛋白，采用噬