TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的人bFGF融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)、純化及其穿透細(xì)胞膜作用的初步研究.pdf

1、目的構(gòu)建含HIV-1的反式激活蛋白Tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Tat-protein transduction domain,TatPTD)的人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(human basic Fibroblast Growth Factor,hbFGF)表達(dá)載體,誘導(dǎo)表達(dá)并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化,用純化的融合蛋白做細(xì)胞因子活性檢測(cè)及研究含TatPTD介導(dǎo)的hbFGF在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用.方法用RT-PCR法擴(kuò)增TatPTD-hbFGF

2、的基因片段,擴(kuò)增產(chǎn)物與T-Vector連接,構(gòu)建表達(dá)載體pGEM-T-TatPTD-hbFGF.在宿主菌中擴(kuò)增重組質(zhì)粒,提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切純化,將目的基因插入pET-28b中構(gòu)建成表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL1-blue,藍(lán)白選擇、耐藥性標(biāo)記粗篩并挑取陽(yáng)性克隆,經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶譜分析、DNA序列分析兩種方法鑒定.然后提取重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL-21,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá).包涵體形式表達(dá)的融合蛋白經(jīng)去污劑變性,梯度透析后,穿陰離子交換

3、樹(shù)脂,得到所需純化目的蛋白.對(duì)純化目的蛋白用ECV304細(xì)胞做MTT細(xì)胞因子活性檢測(cè).并用免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)含TatPTD的hbFGF與不含TatPTD的hbFGF在生物膜穿透性方面進(jìn)行初步研究.結(jié)果經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切圖譜分析和DNA序列測(cè)定證明所構(gòu)建質(zhì)粒為pET-28b-TatPTD-hbFGF重組質(zhì)粒;SDS-PAGE證實(shí)獲得的融合蛋白分子量為21.5kD,表達(dá)量約占菌體總蛋白的24％.純化的蛋白純度為99%;免疫細(xì)胞化學(xué)研究表明,