應用膜片鉗技術研究17β-雌二醇對豚鼠心室肌細胞L-型鈣通道電流的影響.pdf

1、雌激素（Estrogen，E）是一種類固醇激素，其主要成分為雌二醇（Estradiol，E2）。雌二醇有α和β兩種類型，其中β型生物作用強。大量研究表明，雌激素除了對生殖系統(tǒng)具有調控作用以外，在治療更年期綜合征、抗骨質疏松、預防心血管疾病及對中樞神經系統(tǒng)的保護作用等方面都有很高的研究及應用價值。心血管系統(tǒng)疾病是絕經后婦女病死的主要原因之一，大于50歲的婦女約53％死于心血管疾病。絕經后婦女應用雌激素替代療法（Estrogen Repla

2、cement Therapy，ERT）可使心血管疾病的發(fā)病率下降35％-50％，提示雌激素對心血管系統(tǒng)具有保護作用，然而其保護作用的機制目前還不十分清楚。近年來發(fā)現(xiàn)雌激素可直接作用于心肌及血管平滑肌，產生負性變力作用，擴張血管，并且有證據表明雌激素對鈣通道電流有抑制作用。
　　 ERT有導致乳房、卵巢和子宮內膜腫瘤發(fā)生的危險，因此深入研究雌激素對心血管作用的保護機制，尋找一種理想的ERT藥物，盡可能地減少其副作用，將對心血管系統(tǒng)

3、疾病的防治起到重要作用。因此我們應用膜片鉗技術研究17β-雌二醇（17p-E2）對豚鼠心室肌細胞L型鈣通道電流（ICa-L）的影響，從電生理學的角度探討17β-雌二醇的心血管系統(tǒng)保護作用及其作用機制，為開發(fā)安全有效的雌激素替代藥物和指導臨床用藥提供實驗依據。
　　 材料與方法：
　　 1、實驗動物及分組
　　 實驗選用健康成年豚鼠（300-400）g，雌性。實驗分為五組，對照組：記錄正常細胞外液灌流時豚鼠心室肌細

4、胞ICa-L；應用17β-E2三組：分別記錄含17β-E2（10-9、10-8、10-7mol/L）的細胞外液灌流時豚鼠心室肌細胞ICa-L；17β-E2+受體阻斷劑組：用雌激素特異性受體阻斷劑三苯氧胺（Tamoxifen，TAM）（10-7mol/L）預處理1h后，記錄含17β-E2（10-7mol/L）和TAM（10-7mol/L）的細胞外液灌流時豚鼠心室肌細胞ICa-L，。
　　 2、實驗儀器
　　 膜片鉗放大器，

5、數(shù)模轉換器，微操作器，倒置顯微鏡，微電極拉制儀，微電極拋光儀，防震臺，Langendorff灌流裝置，小型動物呼吸機，數(shù)控超級恒溫槽，低速離心機，超聲波清洗器，恒溫水浴鍋，pH計，電子天平，磁力攪拌器，手術器械。
　　 3、溶液與藥品
　　 無鈣臺氏液（mmol/L）、含鈣臺氏液（mmol/L）、KB液（mmol/L）、電極內液、膠原酶（Collagenase）、蛋白酶（Protease）、17β-雌二醇、三苯氧胺。

6、r>　　 4、豚鼠心室肌細胞的分離
　　 1％戊巴比妥鈉按100mg/kg腹腔注射麻醉豚鼠，氣管插管，開胸分離主動脈并插管，分離心臟并連接于Langendorff灌流裝置上，用普通臺氏液灌流3min后換無鈣臺氏液灌流6min，再用含有0.05％膠原酶的無鈣臺氏液灌流10-15min，待心室肌組織消化后，用KB液灌流終止酶的消化，取左心室機械游離單個心室肌細胞，濾網過濾，離心后置于KB液中，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　 5、

7、ICa-L的記錄方法
　　 將分離好的細胞懸液滴于倒置顯微鏡上方的浴槽內，選擇靜止、桿狀、橫紋清晰、折光性良好的單個心室肌細胞，采用全細胞記錄模式記錄ICa-L。
　　 6、電容值的測量方法
　　 打開一個已記錄的ICa-L數(shù)據樣本，選擇鉗制電壓下方的電壓線，確定第n個Sweep，然后在View對話框中的Select Sweep對話框中選擇相應的第n個Sweep，按OK按鈕。調整1，2，3，4光標，然后在數(shù)據統(tǒng)計

8、圖標的對話框中選擇相應的條目，按OK按鈕，在Result對話框中生成相應的曲線下面積值，將曲線下面積值除以10得到電容值。
　　 7、數(shù)據處理與統(tǒng)計學分析
　　 所有數(shù)據在pCLAMP 10.0中進行分析及測量。實驗結果用Mean±SD表示，將給藥組和對照組進行兩組資料t檢驗分析，P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異有高度顯著性。
　　 實驗結果：
　　 1、17β-E2對不同膜電位下豚鼠心室肌

9、細胞ICa-L的影響
　　 17β-E2（10-9、10-8、10-7mol/L）使ICa-L峰電流密度值從（-3.5± 1.4）pA/pF分別減少至（-2.5± 0.2）pA/pF、（-2.1± 0.7）pA/pF和（-1.3± 0.5）pA/pF（與對照組比較，均為P<0.01，n=5）。ICa-L峰電流密度值減少百分數(shù)分別為26.8％、40％和62.9％。電流電壓曲線顯示17β-E2濃度越高抑制的程度越明顯，但I-V曲線的

10、形狀和峰值電壓無明顯變化。
　　 2、TAM預處理后17β-E2對不同膜電位下ICa-L的影響
　　 TAM（10-7mol/L）預處理后，17β-E2（10-7mol/L）使ICa-L峰電流密度值從（-3.5± 1.4）pA/pF減少至（-1.2± 0.5）pA/pF（與對照組比較，P<0.01，n=5），ICa-L峰電流密度減少百分數(shù)為65.7％，與未應用TAM（10-7mol/L）預處理的17β-E2（10-7mo

11、l/L）作用下ICa-L峰電流密度值（-1.3±0.5）pA/pF相比較，ICa-L峰電流密度值無顯著變化（P>0.05，n=5）。
　　 討論
　　 鈣通道是心肌細胞膜上最重要的膜蛋白之一。根據鈣通道的分子生物學及其鈣電流的動力學特征，可將其分為長時間激活型（L型）及瞬時激活型（T型），其中L型鈣通道的開放及鈣離子內流而產生的慢鈣內向電流，在心肌細胞動作電位復極和興奮-收縮偶聯(lián)過程中起重要作用，是決定心肌細胞動作電位平

12、臺期長短的重要因素。
　　 本研究應用膜片鉗全細胞記錄方法，觀察了17β-E2對豚鼠心室肌細胞ICa-L的影響。本實驗發(fā)現(xiàn)17β-E2可抑制ICa-L，且抑制作用呈濃度依賴性，推測17β-E2可能通過抑制ICa-L縮短動作電位平臺期。抑制內向鈣電流或促進外向鉀電流均使動作電位平臺期縮短，17β-E2是否促進鉀外流目前還不清楚。17β-E2抑制ICa-L，使動作電位時程縮短，導致Ca2+內流減少，心肌收縮力減弱，降低心臟作功和心肌

13、氧耗。此外，進入細胞內Ca2+降低，有利于線粒體將堆積的Ca2+排出，減輕Ca2+超載，發(fā)揮對心臟的保護作用。
　　 本實驗發(fā)現(xiàn)17β-E2用雌激素特異性受體阻斷劑TAM預處理后，對ICa-L的抑制作用與未應用TAM預處理相比沒有明顯變化，提示17β-E2抑制ICa-L的作用不是由雌激素核受體介導的，推測該作用可能是通過直接與鈣離子通道上或與鈣通道調節(jié)蛋白的某位點結合而發(fā)揮作用。
　　 本實驗發(fā)現(xiàn)生理濃度的17β-E2能

14、夠抑制ICa-L，這種抑制作用不被雌激素特異性受體阻斷劑TAM阻斷，提示17β-E2對ICa-L的作用可能未通過基因轉錄過程，而是直接作用于鈣通道或通過其他途徑發(fā)揮生物學效應。
　　 結論：
　　 1、17β-E2抑制豚鼠心室肌細胞ICa-L，作用呈濃度依賴性。
　　 2、雌激素特異性受體阻斷劑TAM不能阻斷17β-E2對豚鼠心室肌細胞ICa-L的抑制作用，提示17β-E2對ICa-L的抑制作用可能與ER作用無關