基因工程重組西妥昔單抗質量控制研究.pdf

1、目的：研究基因工程重組西妥昔單抗(Cetuximab)質量控制方法，為質最標準的制定提供科學依據。 西妥昔單抗(Cetuximab)是一種重組人鼠嵌合型單克隆抗體，主要通過干擾癌細胞表面的表皮生長因子受體(EGFR)的蛋白質生長，通過抑制表皮生長因子受體，減少癌細胞進入正常組織的幾率，控制癌細胞的轉移，達到抗癌目的，它是迄今第一個獲得批準治療結腸癌的單克隆抗體藥物。由Imclone、Bristol-Myerssguilb 公司開

2、發(fā)的西妥昔單抗 (商品名為Erbitux)，FDA 2004年2月批準為晚期直、結腸癌三線用藥。迄今為止，國內尚無西妥昔單抗的系統研究，本課題旨在研究基因工程重組西妥昔單抗(Cetuximab)質量控質方法。 方法：本課題根據《中國生物制品規(guī)程》2000年版、《中華人民共和國藥典》2005年版3部以及《人用單克隆抗體質量控制技術指導原則》、《人用重組DNA制品質量控制技術指導原則》的規(guī)定和要求，結合單克隆抗體類藥物的特點，主要

3、采用RP-HPLC和ELISA方法，對西妥昔單抗的理化性質及質量控制方面著重從以下幾個方面進行了研究，為新藥質量標準的制定提供了依據。國內目前還沒有同類單克隆抗體藥物，因此研究內容均未見報道。 Cetuximab成品中由于制劑配方含有甘氨酸、甘露醇和吐溫80保護劑，用經典Lowry法測定Cetuximab 成品蛋白濃度時會產生較強的干擾。本文采用三氯乙酸和脫氧膽酸鈉先沉淀蛋白質，以排除制劑配方的干擾，建立了測定Cetuximab

4、蛋白含量的TCA-Lowry沉淀法，并進行了方法學研究。采用RP-HPLC法分析Cetuximab肽譜，用胰蛋白酶酶切Cetuximab，以Sephasil peptide C<,18>(4.6mm×250mm) 為色譜柱，以0.1％(v/v) TFA/水-0.08％(v/v)TFA/乙腈為流動相，梯度洗脫，用RP-HPLC分析裂解片段，以考察產品與標準品之間同質性以及不同批次之間產品的同一性。 建立了間接ELISA測定Cet

5、uximab抗體含量的方法，利用Cetuximab可與表皮生長因子受體(EGFR)特異性結合，采用EGFR包被酶標板作為固相抗原，加入待測Cetuximab后再加入HRP-anti Human IgG FC，用四甲基聯苯胺(TMB)顯色，酶聯儀測定450nm吸收值，以Erbitux為標準品，以標準品OD吸收值對Erbimx濃度的對數作標準曲線，以樣品OD吸收值在標準曲線上讀出待測樣品中Cetuximab抗體含量，并進行了方法學研究，用于

6、檢測培養(yǎng)液中抗體的表達水平。 建立了檢測Cetuximab抗體親和常數的非競爭ELISA法，經確定最佳EGFR包被濃度范圍、最佳Cetuximab抗體濃度，得到不同濃度EGFR包板條件下與Cetuximab抗體結合反應曲線，計算Cetuximab抗體的親和常數。用于篩選有高親和力抗體的陽性克隆株，并考察Cetuximab單克隆抗體的親和常數，從而建立產品Cetuximab相關的質量標準。 對Cetuximab 抗體的雜