穿膜肽-β-葡萄糖苷酶-西妥昔單抗偶聯物的制備與鑒定.pdf

1、目的：
　　探討應用異型雙功能蛋白偶聯劑衍生物硫代琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺甲基)-環(huán)己烷-1-羧化物(Sulfo-SMCC)制備穿膜肽-β-葡萄糖苷酶-西妥昔單抗偶聯物的可行性，同時檢測偶聯物中的穿膜肽活性、β-葡萄糖苷酶活性及西妥昔單抗活性，為下一步研究其抗腫瘤效應奠定了基礎。
　　方法：
　　1、采用Sulfo-SMCC將氨基水溶性量子點與巰基化穿膜肽進行共價交聯。將偶聯后的穿膜肽-量子點和人膀胱癌EJ細胞

2、共培養(yǎng)，檢測穿膜肽的活性。
　　2、應用硫代琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺甲基)-環(huán)己烷-1-羧化物(Sulfo-SMCC)將西妥昔單抗、β-葡萄糖苷酶進行偶聯。采用SDS-PAGE、比色法、NHS-Alexa Fluor488標記偶聯物進行鑒定二聯偶聯物并檢測β-葡萄糖苷酶、西妥昔單抗的活性。
　　3、采用同上方法將穿膜肽、β-葡萄糖苷酶、西妥昔單抗進行共價偶聯，制備穿膜肽-β-葡萄糖苷酶-西妥昔單抗三聯偶聯物。采用非還

3、原型聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定三聯偶聯物的連接方式和成份;比色法鑒定三聯偶聯物酶活性;采用NHS-Alexa Fluor488對偶聯物進行熒光標記，然后將穿膜肽-β-葡萄糖苷酶-西妥昔單抗三聯物和EJ細胞共培養(yǎng)，檢測三聯偶聯物中的穿膜肽活性及抗體活性。
　　結果：
　　1、穿膜肽活性鑒定結果:將穿膜肽-量子點與EJ細胞分別共培養(yǎng)1小時和2小時后，在Olympus BX51正置熒光顯微鏡下觀察到隨著時間的延長，

4、人膀胱癌EJ細胞內的紅色熒光越來越明顯，而對照組未見熒光，說明穿膜肽具有良好的穿膜活性。
　　2、西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯物的鑒定結果:SDS-PAGE結果示在3泳道高分子端可見清晰的條帶，而在β-葡萄糖苷酶、西妥昔單抗相對應位置未見條帶。比色法結果示，等濃度二聯物的酶活性低于β-葡萄糖苷酶的酶活性(U/L:669.56±39.23 vs870.60±61.34，t=7.863，P＜0.05)，二聯物仍然具有良好酶活性。標記

5、有綠色熒光的西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶二聯物與EJ細胞共培養(yǎng)1小時后，置于Olympus BX51正置熒光顯微鏡下觀察到細胞周圍有綠色熒光，說明偶聯物仍然保持良好的抗體活性;
　　3、穿膜肽-β-葡萄糖苷酶-西妥昔單抗偶聯物的鑒定結果:在電泳圖上可見到4泳道高分子端的清晰條帶，而在β-葡萄糖苷酶、穿膜肽-β-葡萄糖苷酶、西妥昔單抗相對應位置未見條帶出現。比色法測定結果顯示，等濃度三聯物的酶活性低于β-葡萄糖苷酶(U/L:612.7

6、5±10.58 vs917.03±22.72，t=21.02，P＜0.05)，但三聯物仍然保持有一定的酶活性。標記有綠色熒光染料的穿膜肽-β-葡萄糖苷酶-西妥昔單抗三聯物與EJ細胞共培養(yǎng)1小時后，在Olympus BX51正置熒光顯微鏡下觀察到EJ細胞內與周圍有明顯的綠色熒光，說明偶聯物仍保持良好的穿膜活性與抗體活性。
　　結論：
　　Sulfo-SMCC可以將穿膜肽、β-葡萄糖苷酶、西妥昔單抗成功的偶聯在一起，同時三聯物仍